[發明專利]利用DNA穩定性同位素探針原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法

無效

• 申請號: 201410148322.0
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103966318A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 馮有智;林先貴;賈仲君
• 申請（專利權）人: 中國科學院南京土壤研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

1.利用DNA穩定性同位素探針原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）采集水稻土樣品；

（2）進行¹³C-甲酸的微宇宙培育實驗；

（3）利用超高速離心機對¹³C-甲酸培育土壤的微生物總DNA進行離心分層；

（4）對分層后多個浮力密度中的產甲烷古菌基因進行實時定量PCR分析和指紋圖譜分析，判斷該水稻土中是否含有代謝活性的甲酸利用型產甲烷古菌。

2.根據權利要求1所述利用DNA穩定性同位素探針原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，其特征在于所述的微宇宙培育實驗的步驟為：將100 mg ¹³C-甲酸加入到裝有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，用無菌去離子水調至田間土壤最大持水重量的60%，并用氮氣置換玻璃瓶中空氣后用橡膠塞密封，以保持培養體系的厭氧環境；同時以¹²C-甲酸和不加甲酸的處理為分別為對照，放置28℃培養箱恒溫培養，每隔3天抽出1.2 mL上層空氣，利用氣相色譜儀測定甲烷氣體濃度變化，待甲烷濃度開始降低停止培育實驗。

3.根據權利要求1所述利用DNA穩定性同位素探針原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，其特征在于所述的超高速離心分層步驟為：微宇宙培育實驗停止后，用土壤DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA；將2.0 μg的土壤微生物總DNA、Gradient Buffer緩沖液和1.85g/mL氯化銫溶液按0.1 mL、0.9 mL和4.9 mL體積混合，取5.1 mL混合液上超高速離心機；在20℃下45 krpm的離心速度離心44小時；離心結束后，用固定流速泵對離心管中的混合液進行分層，每層340 μL體積，分15層；用PEG6000和70%乙醇洗滌每層DNA。

4.根據權利要求1所述利用DNA穩定性同位素探針原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，其特征在于所述實時定量PCR分析和指紋圖譜分析的判斷方法為：基于如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的產甲烷古菌特異性引物1106F/1378R，利用實時定量PCR對各個浮力密度層中的產甲烷古菌基因拷貝數進行分析；利用PCR-DGGE指紋圖譜和PCA圖對浮力密度重層和輕層中的產甲烷古菌群落組成進行分析；利用系統發育樹分析判斷浮力密度重層中產甲烷古菌物種。