[發明專利]一種沙門氏菌CRISPR分型方法

有效

• 申請號: 201410147709.4
• 申請日: 2014-04-15
• 公開（公告）號: CN103981256A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 宋宏彬;邱少富;李浩;李鵬;易勝杰;謝靖;吳志豪;郝榮章;王立貴;柳楠;楊超杰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

技術領域

本發明涉及一種沙門氏菌分子分型方法，屬于分子流行病學領域。

背景技術

沙門氏菌是一類危害人和動物健康的重要致病菌，其菌屬型別繁多，抗原復雜，因此對沙門氏菌的防治造成了極大的困難。沙門氏菌的分子分型能對其進行準確的診斷和溯源，在分子流行病學方面，這種便捷高效且高分辨率的分型方法對大規模的流行病檢測和沙門氏菌的進化具有極其重要的意義；在臨床治療方面，由于沙門氏菌會在耐藥和毒力方面具有型別特異性，因此對其準確的分型能在很大程度上對病情的發生發展和轉歸有一個提前的預見作用，且在臨床治療和用藥上也能提供一個可靠的依據。

此外，對于沙門氏菌的爆發監測是疾病預防控制機構的重要任務之一，但目前的疾病控制機構存在數量不足及高端分型設備不足等諸多問題。這種新型的分型方法由于原理簡單、操作容易、成本低廉且對實驗室的設備及技術人員的要求不高，因此能在更廣泛的范圍內進行疾病的監測和預警，對我國的疾控事業將會起到一個有利的促進作用。

沙門氏菌菌屬型別繁多，抗原復雜，目前已明確的血清型達2500多種，是引起食源性腹瀉的重要病原菌之一；多為點序列分型(Multilocus?Sequencing?Typing，MLST)技術分辨率高、重復性好，但有時不穩定；脈沖場凝膠電泳(Pulsed?Field?Gel?Electrophoresis，PFGE)是細菌分型的金標準，其技術分辨率高，但比較費時，且對儀器設備要求高，在圖像處理時主觀造成的偏差較難克服。

成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered?regularlay?interspaced?short?palindromic?repeats，CRISPR)是近年來發現的細菌針對噬菌體等外源DNA的獲得性免疫系統。CRISPR系統主要由CRISPR簇，前導序列(leader)和CRISPR相關蛋白基因(CRISPR-associated，cas)基因共同組成。CRISPR簇又由一段不連續的同向重復序列(direct?repeat，DR)和插入其中的間隔序列(spacer)組成。DR序列在一個CRISPR簇中的大小和序列幾乎相同，其在沙門氏菌中的長度基本為29bp。不同CRISPR系統中間隔序列(spacer)的長度為17-84bp，而沙門氏菌中基本為32bp。研究表明，CRISPR的作用原理為：在噬菌體入侵宿主細胞后，CRISPR系統會從外來的噬菌體序列中選取一段序列加工成新的重復序列與間隔序列(repeat-spacer，R-S序列)后重組到CRISPR簇內，使得宿主獲得抵抗相應噬菌體再次入侵的能力。這使得CRISPR系統具有了極其豐富的序列多態性。重要的是，這種CRISPR系統能作為一種記錄細菌與噬菌體相互斗爭的編年史被穩定的遺傳下來，這不僅能在細菌的分子分型上開辟一個新的領域，還能為我們更好的研究細菌的進化和遷徙史提供一條重要的線索。

目前國內外已有利用CRISPR進行細菌分型的相關研究，但由于現存的CRISPR分型方法依據的是對全部CRISPR位點中所有的間隔序列(spacer)進行測序分析后實現的，雖說分辨率極高，但這種分型方法費時費力且建立相關數據庫需要的信息量巨大。

研究發現，間隔序列在細菌進化過程中存在插入和選擇剔除的現象，使得CRISPR結構具有多態性，并且在同一物種的不同菌株間存在一定的差異。因此，CRISPR結構可以作為細菌分型溯源與進化研究的理想位點。目前關于沙門氏菌的CRISPR分型方法國外有4篇有文獻報道(1.Liu，et?al.Appl?Environ?Microbiol77：4520-4526；2.Liu，F?et?al.Appl?Environ?Microbiol77：1946-1956.3.Fabre，et?al.PLoS?One7：e36995.4.Shariat，N.，et?al..BMC?Microbiol?13：254.)，但由于其分析對象為沙門氏菌兩個CRISPR位點的全部間隔序列(spacer)，甚至有些為了提高其分辨率，聯合兩個沙門氏菌毒力基因sseL和fimH，建立了CRISPR-MLVA的多位點分型系統。但以上關于沙門氏菌的CRISPR分型方法仍具有諸多不足，比如分析的spacer數量繁多，且每個CRISPR結構的spacer數量不等，這都不便于實驗室快速的分子分型，具有耗時，不經濟等缺點。