[發明專利]一種快速分離乳腺癌原代腫瘤活細胞方法

有效

• 申請號: 201410146409.4
• 申請日: 2014-04-12
• 公開（公告）號: CN104974985B
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 朱虹光;王漱陽;陳琦;王維
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬于細胞分離技術領域，涉及高純度批量乳腺癌原代腫瘤活細胞快速分離方法。本發明方法包括：獲得離體的乳腺癌新鮮的組織樣品，組織樣品前處理和質控，高純度批量乳腺癌原代腫瘤活細胞快速分離，批量快速分離高純度乳腺癌原代腫瘤活細胞，本方法從乳腺癌組織塊中分離活的乳腺癌細胞，腫瘤細胞純度達90%以上。分離的乳腺癌原代腫瘤活細胞可用于藥敏試驗。本方法克服了現有技術原代乳腺癌細胞分離純度低且極易受成纖維細胞污染等缺陷，能為臨床藥敏試驗提供可靠的研究對象，為原代腫瘤細胞DNA、RNA和蛋白的建庫以及為腫瘤在體研究提供新的方法和更廣闊的材料來源。

技術領域

本發明屬于細胞分離技術領域，涉及乳腺癌原代腫瘤活細胞分離方法，尤其涉及高純度批量乳腺癌原代腫瘤活細胞快速分離方法。分離的乳腺癌原代腫瘤活細胞可用于藥敏試驗。

背景技術

據報道，目前國內外對絕大多數的惡性腫瘤患者手術后采用化學藥物治療。而研究表明，化療只對其中約25%的腫瘤患者有效，對于化療無效的其余75%的患者來說，無疑是忍受了痛苦同時加重了對家庭以及社會的經濟和精神雙重壓力。有研究表明，對那些化療藥物不敏感的乳腺癌細胞給予化療藥物的刺激，將促進腫瘤細胞的EMT和轉移，由此可見，耐藥的腫瘤細胞更容易發生轉移。因此，準確的腫瘤藥敏試驗對腫瘤尤其是乳腺癌的治療和預后的判斷顯得至關重要。

目前，現有技術的腫瘤藥敏試驗中所采用的腫瘤單細胞分離技術是用膠原酶消化分離技術。實踐顯示，該種技術分離得到的單細胞在體外培養的前四周生長的大多數為腫瘤間質中的非腫瘤細胞，即成纖維細胞，很難想像，用非腫瘤細胞為主的成纖維細胞為載體獲得的所謂腫瘤細胞藥敏試驗的結果能在何種程度上準確反映腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。事實上，目前臨床對腫瘤藥敏試驗結果的反饋的確不如人意。鑒于此，國內外業內研究人員均試圖努力改進腫瘤藥敏試驗技術。本申請的發明人認為，只有將高純度腫瘤細胞作為藥敏試驗的載體，將有助于獲得腫瘤細胞對化療藥物敏感性的正確結果，并用以指導臨床正確選擇化療藥物進行抗腫瘤治療。

以乳腺癌為例，腫瘤化療藥敏檢測通常采用體外與體內兩類檢測方法。國內外常用的體外藥敏試驗檢測法有MTT法、CD-DST法和ATP-TCA法。但其中國內業界常用MTT法已遭逐漸淘汰；日本目前常采用CD-DST法；而歐美常采用ATP-生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測技術（ATP-TCA法）。ATP-TCA法是近年來發展起來的較先進的腫瘤藥敏檢測技術，臨床試驗證實該技術的應用提高了腫瘤的療效。美國國立衛生研究院的GOG(GynecologicOncologyGroup)項目組認為ATP-生物熒光體外檢測腫瘤化療敏感性方法是最有發展前途的一種藥敏試驗方法。該技術原理是根據細胞內源性ATP含量與活細胞數呈正相關，測定細胞內源性ATP的含量以反映細胞的活性和活細胞數量，在體外測定經不同濃度化療藥物直接殺傷的培養腫瘤細胞中的ATP含量，從而計算腫瘤細胞的抑制率，進而判斷該腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度。

但是，該ATP-TCA法的前提是所檢測的細胞必須是高純度的乳腺癌腫瘤細胞，該技術中，只有對高純度的乳腺癌腫瘤細胞給予抗腫瘤藥物，才能真正檢測出該藥物對腫瘤細胞的直接殺傷作用，若這些用于做腫瘤藥物敏感性試驗的細胞中除了腫瘤細胞外還含有其他對該藥物敏感的細胞，如成纖維細胞、血管內皮細胞等，那么在給藥時將有大量非腫瘤細胞被殺死，從而出現藥敏試驗的假陽性或療效擴大的結果。這對于個性化治療或預后的預測將會起到誤導的作用，甚至于出現過度治療的危害。