[發明專利]檢測蛋白質穩定性的方法及其應用

有效

• 申請號: 201410146399.4
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN104099357A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 胡榮貴;于濤;陶永輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/867;C12N5/10;C40B40/02;G01N33/68;C12Q1/68
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

技術領域

本發明涉及蛋白質檢測領域。具體地說，本發明涉及檢測蛋白質穩定性的方法及其應用。?

背景技術

蛋白質水平的動態變化是細胞保持活力和進行生命活動的基本特征和必要前提。在任何時間點，細胞內特定蛋白質的水平取決于其合成與降解過程之間的動態平衡。蛋白質的合成主要在核糖體上進行，目前對蛋白質合成的及其調節的過程都了解得相對清楚。?

人類對蛋白質降解過程的研究始于上世紀八十年代，近年來已經發展成為現代生物學的一個非常重要的研究領域。這是因為所有的蛋白都必須被適時的降解，細胞的基本生命過程例如細胞周期的進行才得以成為可能。無數證據表明，許多受到損傷的或者折疊錯誤的蛋白也都必須降解掉，否則正常的細胞功能就會受到影響，從而導致如癌癥、神經退行性疾病等(C.Raiborg和H.Stenmark,2009;Christian?Hirsch等,2009;Steven?Bergink和Stefan?Jentsch,2009)。?

因為很多疾病的病理過程都與蛋白質降解途徑的不正常有關(Salvatore?Oddo,2008;Jeffrey?H?Kordower,2008;Jianjun?Wang,2008)，許多腫瘤細胞與病毒也是利用泛素蛋白酶體系統擾亂蛋白質的降解，從而達到腫瘤細胞的擴散或對宿主細胞的入侵(Daniela?Hoeller和Ivan?Dikic,2009)。目前許多影響蛋白質降解途徑的藥物已經或正在開發之中。已有的研究結果和臨床試驗的數據都顯示這類藥物對很多目前難以治愈的疾病都具有極高的潛在藥用價值(Matthew?D?Petroski,2008;Grzegorz?Nalepa,2006)。?

因此，研究蛋白質穩定性的差異變化對于相應蛋白質受累疾病的預測、及發病、病因、治療藥物的篩選等均存在重要的提示作用，檢測蛋白質穩定性的異常變化對于研究發病機制尤為重要。現在主要的方法是通過Cycloheximide時間梯度實驗來檢測蛋白質的穩定性。然而，這一方法不僅工作量大，而且對于研究蛋白質組學范圍內的蛋白質差異變化無能為力。同時，該方法因實驗的復?雜性而不適用于高通量藥物篩選。?

蛋白質芯片技術可以一次性檢測多種蛋白質的穩定性，但由于抗體的可用性，使得其通量有限，同時也極大的限制了該技術的實用性。利用質譜技術可以實現大規模樣品，蛋白質組學范圍內的蛋白質穩定性變化的檢測，但是質譜技術識別能力有限，對于低豐度蛋白穩定性的變化無法檢測。?

在細胞生物學與分子生物學領域中，熒光蛋白分子具有廣泛的應用。熒光蛋白常常會被用做報告基因，標識目標蛋白的細胞定位，同時可以結合FACS技術，進行目標蛋白分子胞內豐度的相對定量。?

因此，本領域急需能夠實現廣泛應用于全基因組范圍內蛋白質穩定性的檢測，并且易于應用于高通量小化合物篩選的新型檢測方法。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種可用于檢測蛋白質穩定性的融合蛋白以及編碼所述融合蛋白的遺傳構建物、包含所述遺傳構建物的載體、包含所述遺傳構建物或載體的細胞，以及由所述細胞構成的文庫和檢測蛋白質穩定性的方法和應用。本發明方法對蛋白質穩定性的檢測不僅靈敏度和特異性高，而且操作簡便。?

在第一方面，本發明提供一種遺傳構建物，其結構如下式所示：?

5’-A+B+C+D+E-3’，?

其中，?

A表示啟動子；?

B表示由目標蛋白和第一標記蛋白構成的融合蛋白的編碼序列；?

C表示連接肽的編碼序列；?

D表示第二標記蛋白的編碼序列；和?

E表示終止子；?

其中，B和D可以互換。?

在優選的實施方式中，所述啟動子為CMV啟動子。?

在另一優選的實施方式中，B中5’-3’依次包含目標蛋白的編碼序列和第一標記蛋白的編碼序列。?

在另一優選的實施方式中，所述連接肽選自：泛素、泛素截短體、泛素突變體及類泛素、2A短肽等；優選泛素；最優選K(R)飽和突變的泛素。?

在優選的實施方式中，所述第一標記蛋白和第二標記蛋白是熒光蛋白。?

在優選的實施方式中，所述熒光蛋白選自EGFP或RFP；優選第一標記蛋白是EGFP，第二標記蛋白是RFP。?

在優選的實施方式中，所述EGFP是mEGFP，所述RFP是mRFP。?

在優選的實施方式中，所述熒光蛋白C端或N端融合有一個或多個標簽蛋白，例如Flag或myc。?