[發(fā)明專利]檢測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410146399.4
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN104099357A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡榮貴;于濤;陶永輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/867;C12N5/10;C40B40/02;G01N33/68;C12Q1/68
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

1.一種遺傳構(gòu)建物，其結(jié)構(gòu)如下式所示：

5’-A+B+C+D+E-3’，

其中，

A表示啟動子；

B表示由目標(biāo)蛋白和第一標(biāo)記蛋白構(gòu)成的融合蛋白的編碼序列；

C表示連接肽的編碼序列；

D表示第二標(biāo)記蛋白的編碼序列；和

E表示終止子；

其中，B和D可以互換。

2.如權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建物，其特征在于，B中5’-3’依次包含目標(biāo)蛋白的編碼序列和第一標(biāo)記蛋白的編碼序列。

3.如權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建物，其特征在于，所述連接肽選自：泛素、泛素截短體、泛素突變體及類泛素、2A短肽等；優(yōu)選泛素；最優(yōu)選K(R)飽和突變的泛素。

4.如權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建物，其特征在于，所述第一標(biāo)記蛋白和第二標(biāo)記蛋白是熒光蛋白。

5.如權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建物，其特征在于，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列包括人類基因組文庫human?ORFeome?V5.1中所有基因。

6.一種多肽，其結(jié)構(gòu)如下式所示：

B1+C1+D1，

其中，

B1表示由目標(biāo)蛋白和第一標(biāo)記蛋白構(gòu)成的融合蛋白

C1表示連接肽；和

D1表示第二標(biāo)記蛋白；

其中B1和D1可以互換。

7.一種載體，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的遺傳構(gòu)建物。

8.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1-5中任一項所述的遺傳構(gòu)建物或權(quán)利要求7所述的載體。

9.一種細(xì)胞文庫，其由權(quán)利要求8所述的細(xì)胞構(gòu)成。

10.一種檢測一個或多個目標(biāo)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建權(quán)利要求9所述的細(xì)胞文庫；

(2)在所述特定條件下和對照條件下培養(yǎng)(1)所得的細(xì)胞文庫；

(3)測定所述特定條件下和對照條件下培養(yǎng)的細(xì)胞文庫中第一標(biāo)記蛋白與第二標(biāo)記蛋白之比；和

(4)通過比較所述特定條件下和對照條件下培養(yǎng)的細(xì)胞系中第一標(biāo)記蛋白與第二標(biāo)記蛋白之比得出目標(biāo)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是否變化的結(jié)論；或：

采用流式細(xì)胞儀技術(shù)按照第一標(biāo)記蛋白與第二標(biāo)記蛋白之比將細(xì)胞分成n個區(qū)間（n大于等于2），并通過DNA芯片技術(shù)檢測每一區(qū)間中目標(biāo)基因的各自表達(dá)量計算出目標(biāo)基因在各個區(qū)間中的分布情況，并將所述特定條件下和對照條件下培養(yǎng)的細(xì)胞系中目標(biāo)基因分布情況進(jìn)行對比，得出目標(biāo)基因所編碼的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是否變化的結(jié)論。