[發明專利]重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯物的制備和應用

有效

• 申請號: 201410146151.8
• 申請日: 2010-10-25
• 公開（公告）號: CN103933577A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 羅華;范開;張繼蘭;李祥;張益
• 申請（專利權）人: 北京凱因科技股份有限公司;重慶富進生物醫藥有限公司
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K38/21;C07K14/56;C07K1/107;A61P31/20;A61P35/00
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1.重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物在制備用于治療病毒性感染性疾病的藥物中的應用，其特征在于，所述的重組集成干擾素變異體氨基酸序列為SEQ?ID?No：1，聚乙二醇分子以酰胺鍵與重組集成干擾素變異體N末端甘氨酸的α氨基共價連接，而且所述聚乙二醇為分子量20KDa的醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子，并且所述病毒不是VSV。

2.根據權利要求1所述的應用，其中病毒是HBV。

3.根據權利要求1所述的應用，其中其中所述藥物用于抑制HBeAg。

4.根據權利要求1所述的應用，其中醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子是單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛，優選是單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛。

5.根據權利要求1所述的應用，其中所述重組集成干擾素變異體簡稱為IFN-SA，其氨基酸序列為SEQ?ID?No：1，所述重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物簡稱為PEG20-IFN-SA，其特征在于，所述重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物的制備方法包括如下步驟：

(1)IFN-SA溶液用100mmol/L?pH5.5的PB緩沖液配成2mg/mL，加入1mol/L氰基硼氫化鈉母液至終濃度為20mmol/L，按IFN-SA:mPEG-ButyrALD-20KD的摩爾比1∶4稱取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反應溶液中，4℃條件下100r/min攪拌反應24h，取樣進行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-IFN-SA的修飾率；

（2）修飾后樣品PEG20-IFN-SA，用5×DDW透析過夜，透析后樣品上用BufferA平衡后的SP?Sepharose?F.F層析柱，分別用洗脫1、洗脫2、洗脫3、洗脫4、洗脫5進行洗脫，分別收集穿透峰及各個洗脫峰，并取樣分別進行SDS-PAGE電泳分析，其中，所述BufferA的配方為10mM?pH5.5的乙酸-乙酸鈉，所述洗脫1的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.15M?NaCl，所述洗脫2的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.2M?NaCl，所述洗脫3的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.25M?NaCl，所述洗脫4的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.35M?NaCl，所述洗脫5的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.45MNaCl；（3）收集SPSepharose?F.F層析純化后的PEG20-IFN-SA樣品，上Superdex75分子篩，所述分子篩用10mmol/L?pH7.4的PB平衡，平衡好后上樣，再用10mmol/L?pH7.4的PB等梯度分離，隨后收集含PEG20-IFN-SA主峰，分別取樣進行SDS-PAGE電泳分析。

6.一種重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物，其特征在于，所述的重組集成干擾素變異體氨基酸序列為SEQ?ID?No：1，聚乙二醇分子以酰胺鍵與重組集成干擾素變異體N末端甘氨酸的α氨基共價連接，而且所述聚乙二醇為分子量20KDa的醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子。

7.根據權利要求6所述的重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物，其中醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子是單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛，優選是單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛。

8.根據權利要求6或7所述的重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其中腫瘤是腎癌，優選是ACHN細胞株引發的腎癌。

10.重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物制備方法，所述重組集成干擾素變異體簡稱為IFN-SA，其氨基酸序列為SEQ?ID?No：1，所述重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯物簡稱為PEG20-IFN-SA，其特征在于，包括如下步驟：

(1)IFN-SA溶液用100mmol/L?pH5.5的PB緩沖液配成2mg/mL，加入1mol/L氰基硼氫化鈉母液至終濃度為20mmol/L，按IFN-SA:mPEG-ButyrALD-20KD的摩爾比1∶4稱取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反應溶液中，4℃條件下100r/min攪拌反應24h，取樣進行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-IFN-SA的修飾率；

（2）修飾后樣品PEG20-IFN-SA，用5×DDW透析過夜，透析后樣品上用BufferA平衡后的SP?Sepharose?F.F層析柱，分別用洗脫1、洗脫2、洗脫3、洗脫4、洗脫5進行洗脫，分別收集穿透峰及各個洗脫峰，并取樣分別進行SDS-PAGE電泳分析，其中，所述BufferA的配方為10mM?pH5.5的乙酸-乙酸鈉，所述洗脫1的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.15M?NaCl，所述洗脫2的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.2M?NaCl，所述洗脫3的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.25M?NaCl，所述洗脫4的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.35M?NaCl，所述洗脫5的配方為pH5.5的10mM乙酸-乙酸鈉和0.45MNaCl；（3）收集SPSepharose?F.F層析純化后的PEG20-IFN-SA樣品，上Superdex75分子篩，所述分子篩用10mmol/L?pH7.4的PB平衡，平衡好后上樣，再用10mmol/L?pH7.4的PB等梯度分離，隨后收集含PEG20-IFN-SA主峰，分別取樣進行SDS-PAGE電泳分析。