[發明專利]一種可過量表達膜蛋白細菌及其應用

有效

• 申請號: 201410145843.0
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103992979B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 張中鴿;曹張軍
• 申請（專利權）人: 東華大學;張中鴿
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12R1/19
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于生物表面活性劑領域，特別涉及一種可過量表達膜蛋白細菌及其應用。

背景技術

本世紀60至70年代對大腸桿菌的研究使之成為自然界中最普遍為人們所認識的生物體。大腸桿菌具有兩個顯著特征：操作簡單和能在廉價的培養基中高密度培養，它的這些特征加上十多年外源基因表達的經驗使其在大多數科研應用中成為高效表達異源蛋白最常用的原核表達系統。盡管大腸桿菌有眾多的優點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。

正常生理條件下膜蛋白的天然表達水平較低，對其異源大量表達成為功能和結構研究的先決條件。結合膜蛋白純化和結晶的困難，膜蛋白的異源表達也因其疏水特性、細胞脫容量的有限性、對宿主細胞的毒性等問題成為膜蛋白相關研究的瓶頸。尤其對于真核細胞膜蛋白的原核表達，宿主的不相容性往往會帶來更大的難題：截至2005年止，尚無一例以重組表達方式獲得結構信息的膜蛋白的報道。而一個耐受膜蛋白的表達菌對于成功表達膜至關重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可過量表達膜蛋白細菌，該菌株對膜蛋白異常有極大耐受性，采用上述菌株，可過量表達膜蛋白，具有良好的應用前景。

本發明的一種可過量表達膜蛋白細菌，該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia?coli1098-3，保藏號為CGMCC?No.8696，其16S?rRNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。于2014年1月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

本發明的一種可過量表達膜蛋白細菌的應用，具體方法如下：利用超表達載體攜帶外源膜蛋白基因序列，通過電擊轉化或熱激轉化轉入菌株，菌株37℃培養OD₆₀₀至0.3-0.4，加IPTG至終濃度0.7mg/L，培養6-18h，收獲菌種。

所述電擊轉化的工藝條件為：0.2cm的電轉化池放入槽中，1-1.5kV，25uF，200歐；電擊后取出加入1ml?SOB液體培養基，37℃培養1小時；涂布于SD平板。

所述熱激轉化的工藝條件為：100L感受態細胞置于冰上，將細胞均勻懸浮；加入10L連接好的質粒，DNA濃度為10pg/L，混勻；冰上放置30分鐘；42℃水浴熱激55秒；冰上放置10分鐘；加100L?LB培養液，37℃250轉/分振蕩培養30分鐘；與此同時將LB平板置于37℃，放置片刻后加入4uL?IPTG和40uL?X-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附滲透；將細菌涂布在含抗生素瓊脂平板上，平皿在37℃下正向放置1小時，待接種的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置，培養過夜。

本發明描述一種從油污污染土壤中分離得到的細菌，膜厚度大，可耐受較大機械壓力，同時也能夠耐受膜蛋白毒性，可以對膜蛋白外源表達有較好耐性。根據BLAST聚類分析及形態學鑒定結果（見圖1），將該菌株定命名為Escherichia?coli1098-3。該菌經檢測可顯著降低表面張力，國內外已經發現菌株是前所未見或未有應用的。

本發明提供的菌株Escherichia?coli1098-3的特征如下：

本發明該菌菌落圓形，凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，不透明；呼吸類型為好氧呼吸，在有氧條件下生長良好，革蘭氏染色呈陽性，形態觀察菌體桿狀。測定菌株的16S?rRNA部分序列，進行系統發育學分析。

有益效果

本發明對膜蛋白異常有極大耐受性，采用上述菌株，可過量表達膜蛋白，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明菌株16S?rRNA序列系統發育樹；

圖2左圖為普通菌種過量表達膜蛋白細胞結構，右圖為本發明菌株過量表達膜蛋白細胞結構。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

菌種來源：本菌種來源于油污污染土壤，具體分離方法如下：