[發明專利]一種淡水蛭弧菌微生物制劑及快速評價其貨架期的方法

有效

• 申請號: 201410143854.5
• 申請日: 2014-04-10
• 公開（公告）號: CN103952339A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 蔡俊鵬;田雙娥
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明涉及一種微生物制劑，具體涉及一種淡水蛭弧菌微生物制劑及快速評價其貨架期的方法。

背景技術

蛭弧菌(Bdellovibrio-and-like?organisms,BALOs)是一類寄生于其他細菌并依靠裂解宿主菌使自身得以生長繁殖的細菌，它具有寄生和裂解細菌的生理特性，尤其是對許多病原弧菌有良好的裂解作用。在控制細菌及在水產養殖中具有廣闊的應用前景。蛭弧菌在水產養殖中用于控制病原菌，是近幾年來的研究熱點，蛭弧菌對大多數致病菌有較強的裂解能力，能改善水質，安全環保，有可能取代抗生素，成為控制病害的新手段。而蛭弧菌大多存在不易保存的問題而使蛭弧菌的應用得到限制。因此，使蛭弧菌的活性和穩定性得到保障，對擴大蛭弧菌的使用范圍和推廣具有十分重要的意義。

蛭弧菌的生活史由兩個階段組成：自由生活、能運動，不進行增殖的游泳體階段和在特定宿主細菌的周質空間內進行生長繁殖的蛭質體階段。在游泳體階段，蛭弧菌識別并與宿主發生不可逆的結合，然后侵入宿主。蛭弧菌侵入宿主菌后，在其周質空間中利用宿主細胞成分為營養進行絲狀生長，通過復分裂進行增殖，最后裂解宿主細胞并釋放成熟子代個體。

蛭弧菌游泳體是指侵入宿主細菌前的生長形式。蛭弧菌游泳體侵入宿主細菌的過程非常快，一般在幾秒鐘內就能完成。蛭弧菌游泳體相對于蛭質體而言，存在著制備繁瑣、不易保存的弱點，但用蛭弧菌游泳體做活性檢測具有起效快的優點。

溫度是影響蛭弧菌及其制劑穩定性的重要因素之一。在保存時，蛭弧菌普遍存在穩定性差的問題。即蛭弧菌活性易受到外界環境的影響，經儲存后活菌含量已遠遠降低，達不到原有的要求。因此保持并延長高濃度蛭弧菌及其制劑的活力，將蛭弧菌作為“活性抗生素”應用于水產養殖業、食品行業及擴大其應用范圍具有十分重大的意義。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有蛭弧菌活力保持不夠長而導致蛭弧菌的廣泛應用受限的缺點與不足，提供一種淡水蛭弧菌微生物制劑。

本發明的再一目的在于提供上述淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法。

本發明的另一目的在于提供一種快速評價上述淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，包含如下步驟：

（1）制備蛭弧菌游泳體；

（2）在步驟（1）得到的蛭弧菌游泳體加入保護劑，得到貨架期延長的淡水蛭弧菌微生物制劑。

所述蛭弧菌優選為淡水蛭弧菌（Bdellovibrio?sp.）BDS01；

所述的蛭弧菌游泳體的終濃度為10¹⁰PFU(plaque?forming?unit)/mL；

所述的淡水蛭弧菌（Bdellovibrio?sp.）BDS01（該菌株已在中國專利申請號為“200910042274.6”、名稱為“一種防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”中公開）于2009年8月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M209169；對所述的蛭弧菌進行負染后于電子顯微鏡下觀察形態可知：BDS01呈單細胞，弧形，大小為0.9×0.25μm，端生鞭毛，鞭毛長度為4μm；所述蛭弧菌BDS01用雙層平板培養的方法于28℃培養四天可形成直徑1～2mm的透明圓形噬菌斑；

所述保護劑為谷氨酸鈉、蔗糖、內消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的一種或至少兩種；

優選的，所述保護劑為終濃度1%～10%W/V（質量/體積）的谷氨酸鈉、終濃度1%～10%W/V的蔗糖、終濃度1%～10%W/V的內消旋肌醇、終濃度1%～10%W/V的棉子糖、終濃度1%～10%W/V的葡萄糖、終濃度5%～30%W/V的甘油、終濃度1%～10%W/V的蔗糖+終濃度1%～10%W/V的谷氨酸鈉、終濃度1%～10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度1%～10%W/V的內消旋肌醇、終濃度1%～10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度1%～10%W/V的棉子糖、終濃度1%～10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度1%～10%W/V的葡萄糖或終濃度1%～10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度5%～30%W/V的甘油；

進一步優選的，所述保護劑為終濃度5%W/V的谷氨酸鈉、終濃度5%W/V的蔗糖、終濃度5%W/V的內消旋肌醇、終濃度5%W/V的棉子糖、終濃度5%W/V的葡萄糖、終濃度15%W/V的甘油或終濃度5%W/V的谷氨酸鈉+終濃度15%W/V的甘油；