[發明專利]一種降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請號: 201410143487.9
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103901203A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 徐順澍;李永紅;葉興旺;周超;王秀偉;李慶春
• 申請（專利權）人: 蘇州浩歐博生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/76
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛;汪青

1.?一種降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于：包括如下試劑：

降鈣素原系列標準品；

磁分離試劑：偶聯有鏈霉親和素的磁微粒懸浮液，所述的偶聯有鏈霉親和素的磁微粒的濃度為0.2~1.0mg/ml；

第一試劑：含N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯標記的抗降鈣素原單克隆抗體溶液，所述的含N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯標記的抗降鈣素原單克隆抗體的濃度為0.2~2.5μg/ml；

第二試劑：含堿性磷酸酶標記的抗降鈣素原單克隆抗體溶液，所述的含堿性磷酸酶標記的抗降鈣素原單克隆抗體的濃度為0.2~1μg/ml。

2.?根據權利要求1所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于：所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為0.5~2μm，每克磁微粒表面的羧基含量不低于0.4毫摩爾。

3.?根據權利要求1所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于：第一試劑中，所述的抗降鈣素原單克隆抗體與所述的N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯的摩爾比為1：18~22。

4.?根據權利要求1所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于：第二試劑中，所述的抗降鈣素原單克隆抗體與所述的堿性磷酸酶的摩爾比為1:1~2。

5.?根據權利要求1所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于：所述的堿性磷酸酶的純度大于95%，比活性大于1000?U/mg，濃度大于5mg/ml。

6.?根據權利要求1所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于：第一試劑和第二試劑中的抗降鈣素原單克隆抗體的純度均大于95%，濃度均大于1mg/ml。

7.?根據權利要求1至6中任一項所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：

磁分離試劑的制備方法為：將所述的磁微粒用0.04~0.06mol/L、pH4.5~5?的2-嗎啉乙磺酸緩沖液重懸，重懸后磁微粒的濃度為8~12mg/ml；然后加入所述的鏈霉親和素，在15~40℃下混懸30~60分鐘，其中所述的磁微粒與所述的鏈霉親和素的質量比為25~50:1；然后再加入新鮮配置的8~12mg/ml的碳二亞胺水溶液，在15~40℃下混懸2~12h，其中所述的2-嗎啉乙磺酸緩沖液與所述的碳二亞胺水溶液的體積比為10~20:1；磁分離，去上清，用含質量比為0.09~1.1%的牛血清白蛋白、pH為7~7.5、物質的量濃度為0.009~0.01mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液重懸到所述的偶聯有鏈霉親和素的磁微粒的濃度為0.2~1.0mg/ml，即得所述的磁分離試劑；

第一試劑的制備方法為：將所述的抗降鈣素原單克隆抗體用0.01~0.03mol/L、?pH為7~7.5的PBS緩沖液，在2~8℃下透析過夜，配置成抗降鈣素原單克隆抗體溶液；將N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶于二甲基亞砜中配置成N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶液，其中所述的N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯的物質的量濃度為8~12mM；將所述的N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶液加入到所述的抗降鈣素原單克隆抗體溶液中，混合均勻，在15~40℃下放置20~40分鐘；加入0.9~1.1M的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，終止反應，在15~40℃下放置8~12分鐘，然后用含質量比為2.5~3.2%的牛血清白蛋白、pH?為7~7.5、物質的量濃度為0.04~0.06mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋到含N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯標記的抗降鈣素原單克隆抗體的濃度為0.2~2.5μg/ml，即得所述的第一試劑；

第二試劑的制備方法為：將抗降鈣素原單克隆抗體加入到濃度為8~12mg/ml的2-亞胺基硫烷鹽酸鹽偶聯劑中，在15~40℃下靜置18~25分鐘，加入0.09~0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15~40℃下靜置4~5分鐘，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后抗降鈣素原單克隆抗體，2~8℃保存備用；將堿性磷酸酶溶液加入到4~5mg/ml的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，在15~40℃下靜置25~35分鐘，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，2~8℃保存備用；將活化后的抗降鈣素原單克隆抗體和活化后的堿性磷酸酶混合，在2-8℃下靜置12~24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化，獲得連接物濃溶液，在2~8℃保存備用；將所述的連接物濃溶液用含質量比為0.4~0.6%的牛血清白蛋白、pH為7.8~8.0、物質的量濃度為0.09~0.11mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋到含堿性磷酸酶標記的抗降鈣素原單克隆抗體的濃度為0.2~1μg/ml，即得所述的第二試劑；

降鈣素原系列校準品的制備方法為：將降鈣素原純品用pH7~7.5、0.04~0.06mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液分別稀釋到多個濃度后分別凍干，即得所述的降鈣素原系列校準品。

8.?根據權利要求1至6中任一項所述的降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于：包括依次進行的以下步驟：

步驟1：在檢測管中加入待測樣本原液，然后依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在36~38℃下溫育14~16分鐘，其中所述的待測樣本原液、所述的第一試劑和所述的第二試劑的體積比為1:0.9~1.1：0.9~1.1；

步驟2：然后向步驟1溫育后的體系中加入磁分離試劑，混勻，在36~38℃下溫育4~6分鐘，所述的待測樣本原液與所述的磁分離試劑的體積比為1:0.9~1.1；

步驟3：添加磁場，使步驟2溫育后的體系在磁場中沉降，去除上清液，經清洗液多次清洗后，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸；

步驟4：添加磁場，使步驟3混懸后的磁微粒在磁場中沉降，去除上清液，然后加入發光底物，去除磁場，充分混懸后檢測1秒內相對發光強度值。