[發明專利]一種人膽管癌耐藥細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201410142453.8
• 申請日: 2014-04-10
• 公開（公告）號: CN103937744A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 于觀貞;徐冬云;王杰軍;徐英杰;陳智偉;沈滌華;王勇;趙勇;門瓊;黃春錦;李亮;李曉勇;陳宏
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 任益

技術領域

本發明涉及一種耐藥的細胞株，屬于腫瘤生物學領域。?

背景技術

膽管癌（cholangiocarcinoma）是指源于肝外膽管，包括肝門區至下端的惡性腫瘤。膽管癌在全部惡性腫瘤死亡者中所占比例為2.88%～4.65%。膽管癌發病率逐年升高，在個別高發地區十年來膽管癌的發病率甚至已經翻番。發病年齡多為50～70歲，但也可見于年輕人。治愈性切除依然是膽管癌患者的唯一選擇，但因膽管癌臨床癥狀出現較晚，惡性程度高，術后遠期效果仍不容樂觀。?

目前，肝門部膽管癌的化療經驗是有限的，化療藥物的治療效果也不盡如人意，還沒有化療方案被證明具有明顯療效。盡管如此，作為重要的輔助治療手段，化學治療仍可緩解患者癥狀和提高其生存質量。大部分的肝門部膽管癌化療研究是單獨采用5-FU，或者采用5-FU與其它藥物比如順鉑、甲氨蝶呤、亞葉酸鈣、絲裂霉素C或干擾素α等聯合用藥。5-FU與順鉑的聯合使用被認為是標準治療方法之一，據報道腫瘤反應率是20%～40%，而單獨使用5-FU的化療效果較差。研究5-FU的耐藥機制等對于提高膽管癌化療效果具有十分重要的意義，耐藥細胞株的建立是此項研究的重要工具。?

腫瘤耐藥細胞株的建立主要采用逐步增加藥物濃度的持續誘導方法，或是大劑量沖擊間斷給藥法。上述兩種方法的比較研究認為，不同誘導方式會影響獲得的耐藥細胞株的耐藥機理和耐藥程度。持續誘導法以腫瘤細胞最終能在特定濃度化療藥物中穩定生長作為誘導成功的判定標準，此方法比沖擊誘導更易產生耐藥性。腫瘤細胞耐藥程度的判定以耐藥指數（resistant?index，RI）來表示，它是耐藥細胞半數抑制濃度（50%?inhibitory?concentration，IC50）與親代細胞半數抑制濃度的比值。Snow等將耐藥性分為三類，耐藥指數小于5為低度耐藥,耐藥指數5-15為中度耐藥，耐藥指數大于15為高度耐藥。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種針對5-FU耐藥的人膽管癌耐藥細胞株。?

本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種人膽管癌耐藥細胞株，命名為人膽管癌耐藥細胞株RBE/5-FU，已于2014年3月22日，保藏于中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏編號為No：C201441。?

上述人膽管癌耐藥細胞株的培養方法，具體步驟如下：?

A.?將人膽管癌細胞加入細胞培養液進行培養，用胰蛋白酶消化傳代；

B.?當細胞培養至細胞密度達到70%～90%時，更換新鮮的細胞培養液，并在細胞培養液中加入5-FU，使得5-FU在細胞培養液中的作用濃度為25μg/ml，繼續培養，而后棄去5-FU的細胞培養液，并用PBS液清洗；

C.?將清洗后的細胞依次按照步驟A和步驟B的方法，重復培養3～5次，得到在5-FU作用濃度為25μg/ml時，能穩定生長、傳代、復蘇的活細胞；

D.?將步驟B中5-FU作用濃度增至50μg/ml，再將步驟C得到的細胞依次按照步驟A和步驟B的方法，重復3～5次，得到在5-FU作用濃度為50μg/ml時，能穩定生長、傳代、復蘇的活細胞；

E.?將步驟B中5-FU作用濃度增至75μg/ml，再將步驟D得到的細胞依次按照步驟A和步驟B的方法，重復3～5次，得到在5-FU作用濃度為75μg/ml時，能穩定生長、傳代、復蘇的活細胞；

F.?將步驟B中5-FU作用濃度增至100μg/ml，再將步驟E得到的細胞依次按照步驟A和步驟B的方法，重復3～5次，得到在5-FU作用濃度為100μg/ml時，能穩定生長、傳代、復蘇的活細胞；

G.?將步驟F得到的細胞撤去5-FU培養1個月，適時換液，再在5-FU作用濃度為50μg/ml的細胞培養液中維持培養。

歷時9個月即得到人膽管癌耐藥細胞株。?

上述人膽管癌耐藥細胞株用途是構建體外腫瘤耐藥模型。?

上述人膽管癌耐藥細胞株的用途是篩選抗腫瘤藥物。?

上述人膽管癌細胞RBE由中科院細胞室提供。?