[發(fā)明專利]用于適配子篩選的DNA雙鏈分離方法以及適配子篩選方法和新的適配子

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410142420.3
• 申請(qǐng)日: 2014-04-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104974998A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁超;李德芳;何小鵑;呂誠(chéng);姜淼;牛旭艷;劉彪;郭保生;劉進(jìn);何冰;黨蕾;張戈;呂愛(ài)平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/115;C12Q1/68
• 代理公司: 北京市隆安律師事務(wù)所 11323
• 代理人: 劉東方

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以細(xì)胞為靶的核酸適配子篩選過(guò)程中DNA雙鏈的分離方法以及適配子的篩選方法及新的適配子。

背景技術(shù)

核酸適配子(aptamer)是通過(guò)指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，SELEX)篩選得到的、能特異結(jié)合靶物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸(ssDNA或RNA)。核酸適配子與抗體功能類似，但是與抗體相比，核酸適配子具有更多優(yōu)勢(shì)，如更高的親和力與特異性、無(wú)免疫原性、能化學(xué)合成、成本低、可化學(xué)標(biāo)記、穩(wěn)定性好、易于保存等。而且，核酸適配子的靶物質(zhì)更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)，并從單一靶標(biāo)擴(kuò)展至完整的病毒顆粒和細(xì)胞等復(fù)合物靶標(biāo)^[1]。因此，近年來(lái)核酸適配子不斷被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物開(kāi)發(fā)、臨床應(yīng)用等方面。同時(shí)，核酸適配子的篩選技術(shù)也得到不斷發(fā)展，適用性、簡(jiǎn)便性不斷改善^[2]。以細(xì)胞為靶的適配子篩選技術(shù)，即cell-SELEX，是在原SELEX基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞篩選技術(shù)，該技術(shù)是以活細(xì)胞為篩選對(duì)象，不需要事先了解靶細(xì)胞表面的分子特征，通過(guò)引入非靶細(xì)胞進(jìn)行反篩獲得特異性識(shí)別靶細(xì)胞的核酸適配子。其篩選過(guò)程主要包括以下幾個(gè)步驟^[3]：①構(gòu)建文庫(kù)：體外合成中間為30-60nt的隨機(jī)序列、兩端為18-40nt的固定序列的單鏈寡核苷酸文庫(kù)；②孵育篩選：將該文庫(kù)與靶細(xì)胞孵育，收集與靶標(biāo)特異結(jié)合的核酸，然后再與非靶細(xì)胞孵育，收集未結(jié)合核酸；③擴(kuò)增(PCR)：PCR擴(kuò)增與靶細(xì)胞結(jié)合、同時(shí)與非靶細(xì)胞不結(jié)合的核酸，得到雙鏈DNA(dsDNA)；④分離：分離dsDNA，獲得單鏈DNA(ssDNA)亞文庫(kù)，或轉(zhuǎn)錄得到RNA亞文庫(kù)；⑤富集：重復(fù)上述過(guò)程5-20個(gè)循環(huán)，一些與靶標(biāo)有高親和力和高特異性的DNA或RNA分子不斷得到富集；⑥克隆鑒定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)ssDNA的富集情況，待富集達(dá)到一定程度時(shí)，進(jìn)行克隆、測(cè)序和鑒定。

在cell-SELEX篩選適配子的過(guò)程中，分離雙鏈PCR產(chǎn)物，獲得可用于后續(xù)篩選的單鏈DNA亞文庫(kù)是整個(gè)過(guò)程的限速步驟^[4]。目前，分離雙鏈PCR產(chǎn)物最經(jīng)典方法的是生物素-鏈親合素-磁珠法。該方法利用生物素與鏈親合素的結(jié)合特性，該方法包括：首先合成正向引物和反向引物，反向引物進(jìn)行生物素(Biotin)標(biāo)記；然后，PCR擴(kuò)增得到生物素標(biāo)記的dsDNA產(chǎn)物，將dsDNA濃縮純化后，與固定有鏈親合素(Streptavidin)的磁珠孵育，堿變性法打破dsDNA之間的氫鍵，使得Biotin-ssDNA與鏈親合素結(jié)合后固定在磁珠上，游離的另一條ssDNA則被分離出來(lái)，作為后續(xù)篩選的亞文庫(kù)^[5]。然而，最近的研究報(bào)道表明，該方法在堿變性后會(huì)打破鏈親合素與生物素之間的相互作用，使得Biotin-ssDNA脫落下來(lái)，污染ssDNA亞文庫(kù)，二者重新發(fā)生退火反應(yīng)形成雙鏈DNA^[6]。另外，堿變性也會(huì)破壞鏈親合素與磁珠之間的共價(jià)鍵偶聯(lián)，脫落的鏈親合素混入ssDNA文庫(kù)，在后續(xù)與細(xì)胞孵育的過(guò)程中造成細(xì)胞的聚集，影響細(xì)胞的生存狀態(tài)^[4，6]。

因此，有必要對(duì)傳統(tǒng)的生物素-鏈親合素-磁珠法進(jìn)行改良，提高雙鏈分離效率，降低鏈親合素及Biotin-ssDNA對(duì)ssDNA亞文庫(kù)的污染，改善篩選孵育過(guò)程中的細(xì)胞生存狀態(tài)，提高cell-SELEX的成功率。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種新的核酸適配子篩選過(guò)程中DNA雙鏈的分離方法，并進(jìn)一步提供一種改進(jìn)的核酸適配子的篩選方法，本發(fā)明通過(guò)在生物素-鏈親合素-磁珠法獲得ssDNA亞文庫(kù)后引入高分辨率瓊脂糖電泳，對(duì)ssDNA亞文庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，純化后的亞文庫(kù)繼續(xù)用于后續(xù)cell-SELEX篩選，可以成功地篩選細(xì)胞特異性適配子。

本發(fā)明所述適配子篩選過(guò)程中DNA雙鏈的分離方法，包括如下步驟：

1)取由生物素-鏈親合素-磁珠法及堿變性法獲得的螢光素(FITC)-ssDNA亞文庫(kù)溶液用酸進(jìn)行中和；

2)將步驟1)所得中和后溶液進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳；

3)分離ssDNA亞文庫(kù)及其中的污染序列，切取ssDNA亞文庫(kù)的目標(biāo)條帶，通過(guò)小分子量DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收，即得。