[發明專利]用于適配子篩選的DNA雙鏈分離方法以及適配子篩選方法和新的適配子

在審

• 申請號: 201410142420.3
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN104974998A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 梁超;李德芳;何小鵑;呂誠;姜淼;牛旭艷;劉彪;郭保生;劉進;何冰;黨蕾;張戈;呂愛平
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/115;C12Q1/68
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

1.一種用于核酸適配子篩選中DNA雙鏈的分離方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)取由生物素-鏈親合素-磁珠法及堿變性法獲得的FITC-ssDNA亞文庫溶液用酸進行中和；

2)將步驟1)所得中和后溶液進行高分辨率瓊脂糖電泳；

3)分離ssDNA亞文庫及其中的污染序列，切取ssDNA亞文庫的目標條帶，通過小分子量DNA純化回收試劑盒進行回收，即得。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟1)中的酸選自鹽酸或醋酸溶液；所述酸的濃度范圍為50mM-300mM；優選鹽酸的濃度為100mM。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟2)所述高分辨瓊脂糖電泳的條件為：分辨率為20-1000bp，溫度為室溫，電泳時間為30min-1h，電壓為150-180v。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟3)中的小分子純化試劑盒為20bp-100bp分子量范圍的小分子DNA純化試劑盒。

5.一種包含權利要求1-4任一所述方法的核酸適配子的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法還包括由生物素-鏈親合素-磁珠法及堿變性法獲得的FITC-ssDNA亞文庫溶液按以下步驟制得：

1-1)準備隨機ssDNA文庫，FITC標記的正向引物和Biotin標記的反向引物；

1-2)取靶向細胞與隨機ssDNA文庫進行孵育，然后收集含有與靶向細胞結合的ssDNA；

1-3)取上述與靶向細胞結合的ssDNA與非靶細胞進行孵育，收集與非靶細胞不結合的ssDNA進行PCR擴增，得到dsDNA；

1-4)取dsDNA與固定有鏈親合素的磁珠進行孵育，然后加入堿性溶液即得。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟1-1)中，

ssDNA文庫選自：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40nt-TGGACACGGT?GGCTTAGT-3’或

5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-40nt-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTA-3’；

FITC標記的正向引物選自：

5’引物：5’-FITC-ATCCAGAGTGACG?CAGCA-3’或

5’-FITC-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’；

Biotin標記的反向引物選自：

3’引物：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’或

5’-biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟1-2)中靶向細胞選自大鼠間充質干細胞；進一步優選進行如下處理：將健康成年大鼠脫頸處死，無菌條件下取股骨及脛骨，顯露骨髓腔；用含10％FBS的低糖DMEM培養液沖洗骨髓腔沖出骨髓，然后反復吹打制成骨髓單細胞懸液，直接接種于培養瓶中，置37度培養箱培養；更進一步優選48小時后更換培養液，以后每3天換液1次；

所述方法中步驟1-2)中所述非靶細胞選自大鼠肝細胞系BRL-3A；優選進行如下處理：采用無酶的細胞消化液處理生長良好的細胞，按照5×10⁶接種于培養皿中，過夜培養，當細胞長至95％時即可用于文庫篩選。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟1-3)中的擴增條件為：94度預變性3min，94度變性30s，55-56度退火30s，72度延伸30s，最后72度延伸5min。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步驟1-4)中堿選自氫氧化鈉；所述堿的濃度范圍為50mM-200mM；進一步優選包括：dsDNA經濃縮管濃縮后，與鏈親合素-磁珠在37度孵育40min-1h，加入50mM-200mM?NaOH溶液進行堿變性5-7分鐘，取上清液即得。

10.利用權利要求5-9任一所述方法獲得的核酸適配子，特征在于，所述適配子具有SEQ?ID?NO.1或SEQNO.2所示的核苷酸序列。