[發(fā)明專利]絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410142418.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-10
• 公開（公告）號(hào): CN103900883A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀延玉;劉秀;程李香
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張真

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物組織學(xué)技術(shù)領(lǐng)域蛋白定位的輔助研究，具體涉及到在透射電鏡下觀察超薄切片的制作及染色方法。

背景技術(shù)

山羊絨是絨山羊的主要產(chǎn)品。毛囊是一個(gè)形態(tài)和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的皮膚附屬器官，它控制著毛發(fā)的生長(zhǎng)。初級(jí)毛囊生長(zhǎng)粗毛，次級(jí)毛囊生長(zhǎng)絨。皮膚和毛囊的結(jié)構(gòu)特征不僅是其生物學(xué)特性的重要內(nèi)容，且對(duì)毛產(chǎn)量和品質(zhì)有直接重要的影響。目前運(yùn)用透射電鏡對(duì)毛囊進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察是最普遍且最佳的方法，但由于皮膚缺乏實(shí)質(zhì)的組織，角化程度又比較高，相對(duì)比較脆，這個(gè)在超薄切片過(guò)程中會(huì)帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。擁有一套最佳的樣品處理方法，和對(duì)毛囊中不同組織和結(jié)構(gòu)的識(shí)別技能，為毛囊組織學(xué)的研究提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控絨生長(zhǎng)和加快絨山羊育種進(jìn)展具有重要意義。

前人研究所用方法基本停留在光鏡水平，偶有涉及透射電鏡的，也只是對(duì)所用方法大概的描述,且步驟較為繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法。以解決切片完整，沒(méi)有碎裂，透射電鏡下觀察結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，用于絨山羊皮膚超微結(jié)構(gòu)的研究。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其主要特點(diǎn)在于包括有步驟為：

（1）選取成年的絨山羊，從體側(cè)部用剪刀剪取0.8-1.2cm²的皮樣；

（2）樣品的固定：

①第一次固定：剪取0.8-1.2cm²的皮樣，展平在事先準(zhǔn)備好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器內(nèi)固定，2-4℃，6-12h；

②第二次固定：從第一次固定好的皮樣上采取1-1.2mm³的電鏡樣，置于2.5-3%的第二次固定液中固定，2-4℃，5-6h；

（3）將步驟（2）固定好的皮樣用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10-15min；

（4）置入2%的鋨酸2-4℃，固定3-5h；

（5）使用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10-15min；

（6）脫水：使用50%-100%酒精，脫水4-6次，每次10min-15min；使用100%丙酮脫水10-15min；然后再次使用100%丙酮脫水10-15min；

（7）包埋：在按1:1純包埋劑和100%丙酮混合液中第一次浸透3-6h，然后在純包埋劑中浸透10-12h。

所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，還包括步驟為：

（8）染色：第一次使用5%醋酸鈾乙醇溶液30-40min染色，然后第二次使用鉛5-10min染色。

所使用的5%醋酸鈾乙醇溶液的配方：醋酸鈾5克；70%乙醇溶液100ml。

所使用的鉛配方：硝酸鉛2.0克；醋酸鉛1.0克；枸櫞酸鈉3.5克；4%NaOH水溶液18ML；雙蒸水定容至100ML。

所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，所述的第一次固定液為3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀釋液為0.2mol/L的磷酸緩沖液，PH為7.2；第二次固定液為0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛12ml，蔗糖8g，超純水定容至100ml。

所述的絨山羊皮膚用于電鏡觀察的超薄切片的制備方法，所述的包埋劑為20ML，其中MNA（甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐）7ml，SPI-PON812（環(huán)氧樹脂812）9.12ml，DDSA（十二烷基琥珀酸酐）6.17ml，DMP-30（2,4,6-三【（二甲氨基）甲基】苯酚）0.3ml。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明流程簡(jiǎn)單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結(jié)構(gòu)清晰。適用于實(shí)驗(yàn)室科研工作者對(duì)絨山羊皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究。

在透射電鏡下進(jìn)行觀察，本發(fā)明能夠清晰的呈現(xiàn)毛囊的各層超微結(jié)構(gòu)，且在切片過(guò)程中不容易發(fā)生碎片現(xiàn)象。

附圖說(shuō)明：

圖1是絨山羊皮膚毛囊完整的橫切超微結(jié)構(gòu)顯微圖；

圖2是絨山羊皮膚毛囊外根鞘（ORS）和內(nèi)根鞘（IRS）超微結(jié)構(gòu)顯微圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，包括有步驟為：

（1）選取成年的絨山羊，從體側(cè)部用剪刀剪取0.8cm²的皮樣；