[發(fā)明專利]染色質(zhì)免疫共沉淀中動(dòng)物組織的超聲破碎方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410141254.5
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103966317A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張浩;茍文鈺;張倩;班冬梅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫沉淀領(lǐng)域，具體地說，涉及一種染色質(zhì)免疫共沉淀中動(dòng)物組織的超聲破碎方法。

背景技術(shù)

生物的基因調(diào)控和表達(dá)是極其復(fù)雜但有序的過程，而生物體基因組DNA在細(xì)胞中以染色質(zhì)形式存在，而且蛋白質(zhì)和DNA互作是細(xì)胞行使功能的重要基礎(chǔ)。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用可以進(jìn)一步了解基因表達(dá)及其調(diào)控模式。

目前，研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的常見方法的有Western blotting、電泳遷移率變動(dòng)分析、足跡法等（KM Sullivan,R Storb,CD Buckner,et al.Graft-versus-host disease as adoptive immunotherapy in patients with advanced hematologic neoplasms.N.Engl.J.Med.,1989,320:828–834），但這些方法都存在不能真實(shí)反映生理?xiàng)l件下DNA-蛋白質(zhì)互作的局限性。與這些傳統(tǒng)技術(shù)相比較，染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）則是研究DNA-蛋白質(zhì)在體內(nèi)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)方法（Rusk N.Reverse ChIP.Nat Methods,2009,6(3):187）。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)可以定位分析體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA的作用位點(diǎn)，運(yùn)用ChIP技術(shù)與其他方法相結(jié)合，例如與高密度芯片（microarray）、測序（sequencing）、體內(nèi)足跡法等技術(shù)相結(jié)合可以獲得整個(gè)基因組水平的單一轉(zhuǎn)錄因子分布圖譜、反式因子體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)，以及系統(tǒng)揭示核小體定位、組蛋白修飾等表觀遺傳的遺傳機(jī)制。

ChIP技術(shù)的一般技術(shù)流程為：甲醛固定細(xì)胞、交聯(lián)蛋白質(zhì)與染色質(zhì)超聲破碎交聯(lián)復(fù)合物→收集超聲破碎產(chǎn)物→分別加入目的、陰對照蛋白抗體與靶DNA-蛋白復(fù)合物結(jié)合→磁珠吸附收集沉淀的抗體-蛋白-DNA復(fù)合物→清洗、洗脫沉淀得到的復(fù)合物→解交聯(lián)，純化得到的DNA片段→PCR檢測沉淀結(jié)果。

成功的染色質(zhì)免疫沉淀是實(shí)驗(yàn)后續(xù)高通量測序或芯片雜交的前提，然而利用適當(dāng)?shù)某晽l件獲得片段大小合適的DNA-染色質(zhì)復(fù)合物是整個(gè)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)成功的前提。目前，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方案都是針對直接利用細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)、破碎及沉淀的，但使用傳統(tǒng)方法對需要利用動(dòng)物組織直接進(jìn)行交聯(lián)、破碎的染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)很難得到理想的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種染色質(zhì)免疫共沉淀中動(dòng)物組織的超聲破碎方法，該方法能夠得到片段大小合適的DNA-蛋白質(zhì)以利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種染色質(zhì)免疫共沉淀中動(dòng)物組織的超聲破碎方法，所述超聲破碎方法首先將動(dòng)物組織經(jīng)膠原酶消化，具體為：向?qū)嶒?yàn)用動(dòng)物組織加入膠原酶混合溶液，37℃震蕩消化動(dòng)物組織直至動(dòng)物組織塊完全溶解，4℃，700g-900g離心后去上清；

所述膠原酶混合溶液的添加量為每0.01克動(dòng)物組織加入150-250ul混合溶液；

所述膠原酶混合溶液為膠原酶溶液：DPBS溶液(Gibco，C14190，美國)=1:1的溶液。

所述膠原酶溶液為將膠原酶(Ⅰ型)(Sigma，C0130，美國)100mg和BSA(血清白蛋白)2g溶解到PBS100ml中，混合均勻配成的。

作為優(yōu)選，所述震蕩消化的時(shí)間為1.5-3.5h。

進(jìn)一步地，所述超聲破碎方法還包括如下步驟：

1）動(dòng)物組織經(jīng)膠原酶消化，離心后去上清后，加入500-1000ul含蛋白酶抑制劑的組織固定液TSS/PI，離心去上清；

2）加入甲醛終濃度為1%的1×磷酸鹽緩沖液（PBS）混合溶液，室溫下孵化交聯(lián)；

3）加入10×甘氨酸溶液，室溫孵化，離心后去上清；

4）加入含有蛋白酶抑制劑的1×PBS溶液，冰上孵育，離心后去上清，重復(fù)兩次；

5）加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞溶解緩沖液TLB/PI，冰上孵育，離心去上清后；

6）加入含有蛋白酶抑制劑的ChIP稀釋液；

7）超聲破碎DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，收集不同超聲條件得到的產(chǎn)物，加入RNaseA，37℃孵育30min；

8）加入蛋白酶K，62℃孵育2h；

9）瓊脂糖電泳篩選片段大小集中于200-500bp的超聲破碎產(chǎn)物。