[發(fā)明專利]產(chǎn)L-丙氨酸且耐受自來水的菌株及構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410140656.3
• 申請(qǐng)日: 2014-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN103898150A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張學(xué)禮;郭恒華;張冬竹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽華恒生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19;C12R1/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及產(chǎn)L-丙氨酸且耐受自來水的菌株及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

L-丙氨酸作為人體非必需氨基酸，在生物體內(nèi)由甘氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至丙酮酸而成。L-丙氨酸是一種白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，帶有甜味，易溶于水，在食品及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途。在食品工業(yè)領(lǐng)域，L-丙氨酸可提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，加入L-丙氨酸后能夠明顯提高食品及飲料中蛋白質(zhì)利用率。L-丙氨酸能夠改善人工合成甜味劑的味感，使其如同天然甜味劑。另外，L-丙氨酸還能夠改善有機(jī)酸的酸味，使其更接近自然味道。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-丙氨酸常被用作氨基酸類營養(yǎng)藥，同時(shí)L-丙氨酸也是制造維生素B6、合成泛酸鈣和其他有機(jī)化合物的重要原料。

目前，L-丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中化學(xué)合成法主要有丙酸氯化氨化法、α-溴丙酸氯化法和氰醇法。這些方法都需要石油基原材料，如丙酸、α-溴丙酸、乙醛和氫氰酸等，因此成本受困于原油價(jià)格。隨著石油價(jià)格的提升，成本會(huì)越來越高。另外，這些方法都是經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)催化完成的，污染重，分離提取成本高，不適合可持續(xù)發(fā)展的需要。

生物法生產(chǎn)L-丙氨酸目前主要是以L-天冬氨酸為原料，在天冬氨酸-β-脫羧酶的催化下進(jìn)行脫羧反應(yīng)生產(chǎn)L-丙氨酸。該方法是目前國內(nèi)L-丙氨酸生產(chǎn)廠家主要使用的生產(chǎn)技術(shù)。但是由于該方法中的原材料天冬氨酸的生產(chǎn)是以順酐為原料的，因此L-丙氨酸的生產(chǎn)成本依舊依賴于石油價(jià)格。隨著石油資源的匱乏和價(jià)格的提升，順酐資源的緊張和價(jià)格上漲將導(dǎo)致天冬氨酸的供給存在巨大的隱患，從而會(huì)影響到L-丙氨酸的生產(chǎn)及成本。

隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，近年來使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸的研究越來越受到重視。微生物發(fā)酵法能夠?qū)崿F(xiàn)以葡萄糖等糖類為原料生產(chǎn)L-丙氨酸。葡萄糖屬于可再生的生物質(zhì)資源，可以通過廣泛存在于自然界中的木質(zhì)纖維素降解獲得。因此，使用其作為原材料，能夠使L-丙氨酸的生產(chǎn)成本保持在穩(wěn)定的水平，具有長遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。目前，已經(jīng)有多株能夠生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株的報(bào)道。Smith等構(gòu)建了一株E.coli?ALS929(pTrc99A-alaD)菌株，其中在質(zhì)粒中表達(dá)的丙氨酸脫氫酶AlaD能夠?qū)麅?nèi)生成的丙酮酸轉(zhuǎn)化為L-丙氨酸，該菌株經(jīng)過48小時(shí)發(fā)酵后，能夠生產(chǎn)88g/L的L-丙氨酸。Lee等構(gòu)建了一株E.coli?ALA887(pTrc99A-alaD)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)能夠在27小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)32g/L的L-丙氨酸。在這些菌株中，丙氨酸脫氫酶是生產(chǎn)L-丙氨酸的關(guān)鍵步驟，在報(bào)道的菌株中，編碼該蛋白的基因一般是通過高拷貝質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)的。在進(jìn)行菌株培養(yǎng)基發(fā)酵過程中，需要添加抗生素來維持質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。這些因素將導(dǎo)致發(fā)酵過程工藝復(fù)雜并提高L-丙氨酸生產(chǎn)的成本。因此，隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的L-丙氨酸生產(chǎn)菌株并經(jīng)過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸將是未來的發(fā)展趨勢(shì)。

目前菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸使用的都是由蒸餾水配置的培養(yǎng)基，蒸餾水在工業(yè)生產(chǎn)中提高了生產(chǎn)的成本。開發(fā)能夠直接使用自來水配置的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株并用于生產(chǎn)，將極大的降低L-丙氨酸的生產(chǎn)成本。但是相對(duì)于蒸餾水，自來水中存在大量的離子并且濃度較高。為了獲得能夠直接使用自來水配置的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵的菌株，需要提高菌株對(duì)高離子濃度的耐受力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供產(chǎn)L-丙氨酸且耐受自來水的菌株的構(gòu)建方法。

本發(fā)明提供的構(gòu)建重組菌（XZ-A45）的方法，包括如下步驟：將出發(fā)菌染色體上的clpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白的編碼基因，得到的重組菌；

所述clpA*蛋白的氨基酸序列為將所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位異亮氨酸I突變?yōu)榻z氨酸S。

上述方法中，所述clpA*蛋白為由序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸編碼的蛋白。

上述方法中，所述clpA*蛋白編碼基因?yàn)閷⑺鯿lpA蛋白編碼基因核苷酸序列第1895位的堿基為T突變?yōu)镚得到的基因。

上述方法中，所述clpA*蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸。

上述方法中，所述將出發(fā)菌染色體上的clpA蛋白編碼基因替換為clpA*蛋白編碼基因?yàn)閷⒑兴鯿lpA*蛋白編碼基因的DNA片段Ⅱ同源重組到所述出發(fā)菌中。

上述方法中，所述DNA片段Ⅱ的核苷酸序列為序列表中序列2。