[發(fā)明專利]鑒定小麥葉銹菌生理小種THTS特異引物應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410139689.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104975073A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆紅飛;張林亞;楊文香;劉大群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的引物序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

由小麥葉銹菌(Puccinia?triticina)引起的小麥葉銹病是世界麥區(qū)普遍發(fā)生的病害之一，其發(fā)生與流行使小麥產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，是影響世界小麥生產(chǎn)的重要障礙。由于小麥品種和發(fā)病時(shí)期不同，可造成7%-30%，甚至50%以上產(chǎn)量損失（Huerta-Espino?et?al.?2011）。實(shí)踐證明，控制該病害最經(jīng)濟(jì)、安全、有效方法是抗病品種的應(yīng)用。但品種抗葉銹性的喪失是抗病品種應(yīng)用的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題,?其主要原因是葉銹菌變異和新毒性小種的產(chǎn)生。因此，小麥葉銹菌生理小種監(jiān)測(cè)及流行預(yù)報(bào)已成為防治小麥葉銹病、指導(dǎo)小麥抗病品種選育和布局的重要環(huán)節(jié)。但小麥葉銹菌是一種專性寄生菌,?無(wú)法進(jìn)行人工培養(yǎng),?而生理小種的常規(guī)鑒定與監(jiān)測(cè)方法繁雜、費(fèi)工費(fèi)時(shí),?準(zhǔn)確性也易受到鑒定條件的影響,?因此,?需尋找一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確性高的新方法。

目前，DNA標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于真菌群體生物學(xué)、流行學(xué)研究。RAPD、RFLP、AFLP和SSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于小麥葉銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。其中SSR標(biāo)記因其多態(tài)性高、共顯性、穩(wěn)定性好而得到了廣泛應(yīng)用，但目前小麥葉銹菌生理小種特異性的分子標(biāo)記還很少，無(wú)法利用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行快速的小種鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的引物序列，用于快速鑒定待測(cè)小麥葉銹菌生理小種類型。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述引物序列為Ptssr0125，由序列表中上游序列（20個(gè)堿基）和下游序列（20個(gè)堿基）組成，表1。

表1用于檢測(cè)抗葉銹基因的兩引物上下游序列

引物名稱上游序列下游序列Ptssr01255' ATCGTGTCATGCAACCAAAA 3'5' AGAGAGGGACGTGAGGGATA 3'

本發(fā)明所提供的用于鑒定小麥葉銹菌生理小種的分子標(biāo)記是Ptssr0125，由引物Ptssr0125擴(kuò)增獲得200?bp和178bp條帶。

本發(fā)明還提供了引物序列在篩選小麥葉銹菌生理小種中的應(yīng)用。

本發(fā)明應(yīng)用的具體方法為：以待測(cè)小麥葉銹菌基因組DNA為模板，利用引物Ptssr0125進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)有200bp和178bp條帶時(shí)，則待測(cè)小麥葉銹菌株的生理小種類型為T(mén)HTS。

本發(fā)明應(yīng)用中所述的PCR擴(kuò)增：

20?μl?PCR反應(yīng)體系為：模板DNA?60?ng，Taq?酶0.5?U，上、下游引物（5?μmol·L^-1）各0.4?μL，dNTP（10?mmol·L^-1）0.4?μL，10?×?PCR?緩沖液2?μL，用無(wú)菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20?μL；

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?4?℃?5?min；然后94?℃?30?s，55℃?30?s，72℃?1?min，共35個(gè)循環(huán)；最后72?℃?5?min，4℃保存。

本發(fā)明應(yīng)用中所述的對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)是：對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在10％(w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后銀染顯色。

采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明提供了一個(gè)新的小麥葉銹菌生理小種THTS的EST-SSR特異標(biāo)記，利用該標(biāo)記可快速鑒定、監(jiān)測(cè)生理小種THTS，從而為建立具有實(shí)用價(jià)值的中國(guó)小麥葉銹菌生理小種的分子監(jiān)測(cè)技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。