[發明專利]一種檢測人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201410139592.5
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103911389A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 辛洪波;陳廷濤;魏強;王婧;鄧侃
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/45;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所 36122
• 代理人: 夏材祥

技術領域

本發明涉及一種檢測人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法。?

背景技術

呼吸道合胞病毒(Respiratory?syncytial?virus,RSV)是世界范圍內引起下呼吸道感染的重要病原體之一,它可以在各個年齡組引起呼吸道感染,尤其見于嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者等急性的呼吸道感染。RSV的感染率很高,超過65%的兒童在1歲前感染過RSV，2歲時，感染率達100%，在發達國家致死率一般約在2%，而在一些發展中國家高達7%-8%。我國不但有RSV散發性感染，還發生過數次大規模爆發流行，如1997年津冀地區發生一次RSV所致的喘憋性肺炎暴發流行，造成447,216人感染，10,522人住院，86人死亡。因此，RSV病毒檢測方法的建立對于有效診斷和治療呼吸道感染至關重要。?

與單一ＲSV?感染相比，混合感染組患兒熱程更長，更多存在肝腫大及ESＲ?異常。單一ＲSV?感染患兒更多見喘息、氣促、流鼻涕等癥狀，病情相對較重，且與年齡呈負相關。目前，RSV檢測試劑盒多以RSV病毒G蛋白和F蛋白的混合物作為抗原進行包被，主要是針對混合感染而言，因此，開發針對單一的RSV感染的試劑盒很迫切。?

RSV病毒G蛋白和F蛋白核苷酸序列含有大量的原核生物稀有密碼子導致其在原核表達系統中僅少量表達或者不表達，因此目前市售RSV檢測試劑盒多為哺乳動物細胞表達的G蛋白和F蛋白作為包被抗原。鑒于真核表達系統與原核表達系統相比具有時間周期長、產量低、成本高等缺點，我們對RSV病毒G蛋白和F蛋白基因的密碼子、表達載體的啟動子、分泌表達宿主菌進行了優化和選擇，從而滿足RSV病毒G蛋白和F蛋白的原核系統高量表達并用于實際生產。?

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法。?

本發明是利用優化過的G和F蛋白基因上清表達上述兩種蛋白，之后將其作為抗原包被Elisa板子，最終實現對呼吸道合胞病毒感染者的準確檢測。。?

本發明所述制備方法包括下列步驟：?

1、G和F蛋白的密碼子優化：由于原始的G和F蛋白不適合原核系統進行表達，因此根據原核細胞密碼子使用原則對G和F蛋白進行優化，使其具備可在原核系統中大量表達的特性；

2、載體構建：以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-對優化后的G蛋白基因進行擴增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點，分別為Nco?和Xho?，PCR條件為：94?℃，反應5?min；隨后進行30個循環：94℃?60?秒;56℃，60?秒;72℃，1?分鐘；最后72℃延伸7分鐘，得到PCR產物約為900?個堿基對，同理，以FL上游引物-?catgCCATGGAACTGCCGATTCTG?-，FL下游引物-?tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA?-對優化后的F蛋白基因進行擴增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點，分別為Nco?和Xho?，PCR條件為：94?℃，反應5?min；隨后進行30個循環：94℃?60?秒;56℃，60?秒;72℃，1.5?分鐘；最后72℃延伸7分鐘，得到PCR產物約為1700?個堿基對，將得到的G和F基因克隆至商品化質粒pET28c(+)中，分別構建pET28c-GL和pET28c-FL重組質粒；

3、重組質粒的轉化和驗證：將pET28c-GL和pET28c-FL轉化至Top10感受態細胞，之后通過菌落PCR和基因測序確定序列是否正確；

4、將驗證無誤后的pET28c-GL和pET28c-FL轉化至Rosetta細胞，進行蛋白表達；

具體操作為：從Top?10?cell提取質粒，轉化進Rosetta?細胞中，涂平板，37℃下培養；挑取卡那平板上生長的單菌落，加入到20?毫升LB培養液中，37℃下，220轉/分搖床上過夜培養；取1%的過夜培養的菌液接種到200?毫升?LB培養液中，37℃下,220轉/分搖床上培養2小時；待菌液渾濁度OD600=0.5時，將搖床溫度降到16℃，加入終濃度0.5毫摩爾/升的IPTG過夜誘導；將誘導后的培養液離心收集菌體，之后轉移至50?毫升離心管，每管加入25毫升裂解液重懸細胞，進行超聲破碎，超聲破碎5?秒停8?秒，如此超聲破碎2～3個循環，超聲破碎機功率20%，至菌液澄清透亮即可；?在4℃下，10000?轉/分，離心10?分鐘，收集的上清即可作為抗原進行包被。