[發明專利]一種檢測人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201410139592.5
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103911389A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 辛洪波;陳廷濤;魏強;王婧;鄧侃
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/45;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所 36122
• 代理人: 夏材祥

1.一種檢測人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法，其特征是：

A、G和F蛋白的密碼子優化：由于原始的G和F蛋白不適合原核系統進行表達，因此根據原核細胞密碼子使用原則對G和F蛋白進行優化，使其具備可在原核系統中大量表達的特性；

B、載體構建：以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-對優化后的G蛋白基因進行擴增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點，分別為Nco????????????????????????????????????????????????和Xho?，PCR條件為：94?℃，反應5?min；隨后進行30個循環：94℃?60?秒;56℃，60?秒;72℃，1?分鐘；最后72℃延伸7分鐘，得到PCR產物約為900?個堿基對，同理，以FL上游引物-?catgCCATGGAACTGCCGATTCTG?-，FL下游引物-?tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA?-對優化后的F蛋白基因進行擴增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點，分別為Nco?和Xho?，PCR條件為：94?℃，反應5?min；隨后進行30個循環：94℃?60?秒;56℃，60?秒;72℃，1.5?分鐘；最后72℃延伸7分鐘，得到PCR產物約為1700?個堿基對，將得到的G和F基因克隆至商品化質粒pET28c(+)中，分別構建pET28c-GL和pET28c-FL重組質粒；

C、重組質粒的轉化和驗證：將pET28c-GL和pET28c-FL轉化至Top10感受態細胞，之后通過菌落PCR和基因測序確定序列是否正確；

D、將驗證無誤后的pET28c-GL和pET28c-FL轉化至Rosetta細胞，進行蛋白表達；

具體操作為：從Top?10?cell提取質粒，轉化進Rosetta?細胞中，涂平板，37℃下培養；挑取卡那平板上生長的單菌落，加入到20?毫升LB培養液中，37℃下，220轉/分搖床上過夜培養；取1%的過夜培養的菌液接種到200?毫升?LB培養液中，37℃下,220轉/分搖床上培養2小時；待菌液渾濁度OD600=0.5時，將搖床溫度降到16℃，加入終濃度0.5毫摩爾/升的IPTG過夜誘導；將誘導后的培養液離心收集菌體，之后轉移至50?毫升離心管，每管加入25毫升裂解液重懸細胞，進行超聲破碎，超聲破碎5?秒停8?秒，如此超聲破碎2～3個循環，超聲破碎機功率20%，至菌液澄清透亮即可；在4℃下，10000?轉/分，離心10?分鐘，收集的上清即可作為抗原進行包被。