[發明專利]一種二倍體泥鰍微衛星家系鑒定方法及其應用

有效

• 申請號: 201410139536.1
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN103966316A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 曹小娟;王衛民;白曉慧;田先暢
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

技術領域

本發明涉及魚類遺傳育種的分子標記輔助技術，具體涉及一種利用熒光標記微衛星標記鑒定二倍體泥鰍家系的方法。

背景技術

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)是一種小型淡水經濟魚類，隸屬于鯉形目，花鰍亞科，鰍科、泥鰍屬，廣泛分布于中國、日本、韓國、俄羅斯以及東南亞等國家和地區，在我國除青藏高原外，從南至北均有分布。泥鰍肉質鮮美、營養豐富，又可入藥，被譽為“水中人參”。不僅國內市場需求旺盛，也是我國外貿出口的主要淡水魚類之一。

泥鰍對環境適應性強，可在池塘、稻田、網箱和木箱進行養殖，也采用無土工廠化養殖，是理想的養殖對象。近幾年來，泥鰍人工養殖在我國迅速發展，養殖的苗種多是由野生捕撈或未經系統選育的野生親本人工繁殖而來，苗種質量良莠不齊，其生長速度、抗病能力和其它養殖性能等還未達到良種化的程度，因此，盡快開展泥鰍良種選育工作是促進泥鰍養殖業穩定、健康發展的必要手段。

在魚類遺傳育種研究中，清晰的系譜信息對于家系的選育和親本的管理至關重要。傳統的水產動物選擇育種中，為了保持家系信息，需要對不同的家系分養，所需水體大且不便管理，更重要的是，不同的環境因素會使育種相關的遺傳參數估計產生偏差，不利于育種計劃的制定。在混合養殖群體中保持家系信息，大多數畜牧上的研究以物理標記為手段，而物理標記對于水產動物存在操作繁瑣、對生長產生一定影響等局限性，尤其是對幼體傷害較大。而且，即使可以應用物理標記，也需要魚體長到足夠大時才能操作，標記之前的分養仍會帶來環境誤差。分子標記的出現使得混養親緣關系的鑒定成為可能，以微衛星分型為基礎的親子鑒定技術是目前水產動物系譜確認中應用最廣泛最可靠的手段之一。已應用到凡納濱對蝦、中國對蝦、牙鲆、大菱鲆、哲羅魚等水產經濟動物育種中。目前，尚未見到任何將微衛星標記應用于泥鰍家系鑒定研究的報道。

發明內容

本發明的目的是利用熒光標記的多態微衛星標記建立二倍體泥鰍的親子鑒定平臺，用于泥鰍家系的親子鑒定和家系管理，為泥鰍分子標記輔助育種提供準確的微衛星標記檢測技術。

本發明包括以下四個步驟：

1）選擇健康發育良好的二倍體泥鰍作為親本進行人工全同胞家系繁殖，剪取每個親本的鰭條組織放于無水乙醇內，于-20℃保存備用；

2）利用醋酸銨法提取二倍體泥鰍親本和子代的基因組DNA；

3）多態性微衛星標記的篩選和引物的合成：選取8對微衛星引物，按照片段大小分為三組，第一組Mac133、Mac429、Mac37，第二組Mac477、Mac605、Mac456，第三組Ma112、Mac449，在正向引物的5’端分別用FAM、ROX、HEX三種不同的熒光基團進行修飾，用于PCR分析；

4）采用熒光PCR反應對親本及子代的DNA樣品進行PCR擴增，擴增產物按照步驟3）中所選微衛星引物分組的方法進行混合，作為上機檢測的樣品，樣品在ABI3730XL基因分析儀上進行分型，用GS-500LIZ作為內參，用GeneMapper3.5軟件讀取每個樣品的基因型；

5）采用CERVUS3.0軟件對親本基因型和子代基因型進行分析，判定子代個體的父母本。

步驟3）所述的8對微衛星引物的核苷酸序列如下所示：

Mac133F:CTGCATGCTCTTGCATAGGA R:CATTCATATTCCACCCTCTCG

Mac429F:TATGTGAGGAAGATAAGCAG R:GAATCCAGATCAAAGCAATC

Mac37 F:GCAAGTACATGCTCATCCTT R:CACCTGCATTCCTTACATCT

Mac605F:ATTCTGAAGGTCACCGTTGT R:GCAGCCGTTAATACACTGTC

Mac477F:CTGAGACTCTTTATGTCTCAC R:CTATCAAGGGAACTGAATGG

Mac456F:TCTCCTCTGACACCATCAGG R:GTACGGACACGAGTCTGGAA

Ma112 F:AGATGTACTGCACTTTCTTTA R:GAATAGCCTATATGTAAATGT

Mac449F:CCCTCCACTTCAACCCTACA R:GACCCTGCTGTCATCTCACA。

本發明的有益效果是：