[發(fā)明專利]抗HER2的多克隆抗體及其制備和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410139514.5
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103910800A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設計）人: 畢愛國;劉誠;周冬冬
• 申請（專利權）人: 杭州雅盛生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/02;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 高文迪

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程領域，特別是指一種抗HER2的多克隆抗體及其制備和應用。

背景技術

HER2，即人類表皮生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2)，又名ErbB2/neu，為表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族成員之一。1987年，Slamon等在一項189名人乳腺癌的研究中首次報道了HER2在乳腺癌癌細胞中的表達，指出HER2基因在乳腺癌的生物學行為和發(fā)病機制中有重要作用。HER2基因，最初是通過乙基亞硝脲誘導大鼠神經/膠質纖維瘤中發(fā)現的一種轉化基因，定位于人染色體17q21上，編碼分子量為185KD的跨膜蛋白，亦稱作p185，HER2蛋白由1255個氨基酸組成，包括胞外結構域(ECD)、跨膜結構域和細胞內結構域(ICD)三部分，其中第1-22個氨基酸是信號肽，23-652個氨基酸是胞外區(qū)，跨膜區(qū)由22個氨基酸組成強疏水區(qū)，胞內區(qū)由580個氨基酸組成絡氨酸酶活性區(qū)。HER2結合在細胞膜表面，具有酪氨酸激酶活性，參與細胞的生長和分化的信號傳導。EGFR家族其它配體無法激活HER2，但HER2可與自身結合形成同源配體二聚體，且可與ErbB其他家族成員結合形成異源二聚體，進而激活胞內受體酪氨酸激酶結構域，通過Ras-MAPK途徑或PI3K-AKT途徑，促進細胞的增殖和分化。

HER2在正常組織中可有微弱的表達，但無基因擴增，其在組織中基因擴增及過度表達與細胞的癌變及多種惡性腫瘤的預后密切相關。

HER2是最重要的乳腺癌預后判斷因子之一，HER2陽性的乳腺癌，其生物學行為和臨床特點有極其特殊的表現，治療方法和模式也與其他類型的乳腺癌有很大的區(qū)別。乳腺癌(mammarycarcinoma)是女性最主要的惡性腫瘤，全國乳腺癌發(fā)病率以每年3%的比率遞增，成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤。乳腺癌術后經系統(tǒng)的化療、放療或內分泌治療等治療方法，可獲得臨床癥狀緩解，但HER2基因的擴增可導致腫瘤復發(fā)和臨床預后較差，可出現復發(fā)或轉移。根據個體差異來選擇合適的乳腺癌治療方法，并有效地預防其復發(fā)或轉移，是乳腺癌治療中亟待解決的最重要問題。研究發(fā)現，20%～30%的乳腺癌患者存在HER2的過表達，HER2的過表達常提示腫瘤的惡性程度高。HER2基因的擴增和過度表達不僅能有效預測乳腺癌患者的預后，而且可以預測乳腺癌對多種治療方法，包括內分泌治療和化療是否敏感，更成為是否選用Herceptin單抗治療復發(fā)轉移性乳腺癌的必要條件。目前，HER2的表達情況已作為乳腺癌獨立預后指標及選擇治療的重要標準，臨床上對乳腺癌患者進行預后的判斷主要依據免疫組化(immunohistochemistry，IHC)和熒光原位雜交技術(fluorescentinsituhybridization，FISH)的結果，而IHC是乳腺癌檢測的金標準方法，該方法靈敏度高，特異性強，定位準確，可發(fā)現微小轉移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術范圍的確定，為臨床合理的治療方案提供可靠依據。

發(fā)明內容

本發(fā)明采用重組HER2抗原，采用雞免疫技術制備多克隆抗體IgY，獲得了有高結合效價的多克隆抗體IgY。因此，本發(fā)明一方面提供了一種對HER2蛋白具有高結合效價的多克隆抗體IgY。

本發(fā)明另一方面提供了由上述的雞免疫技術所制備的多克隆抗體，或其活性片段或其保守性突變體。進一步地，本發(fā)明的抗體可根據其抗原結合區(qū)域（例如重鏈和輕鏈可變區(qū)）發(fā)展出的各種衍生抗體，可以用于被動免疫治療或者預防由HER2過度表達產生的惡性腫瘤，如人源化抗體。

由于本發(fā)明的多克隆抗體IgY對于HER2蛋白有高水平的中和效果，所以本發(fā)明提供了本發(fā)明的多克隆抗體IgY或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合在制備用于檢測HER2抗原的試劑、藥劑或試劑盒中的應用。

本發(fā)明的再一方面提供了試劑、藥劑或試劑盒，其包括本發(fā)明所述的多克隆抗體IgY或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合。所述試劑、藥劑或試劑盒可用于檢測HER2抗原，從而可進一步用于診斷由HER2過度表達產生的惡性腫瘤。

本發(fā)明提供的HER2抗原的檢測方法，優(yōu)選的，采用免疫組化法進行HER2蛋白的檢測。即以人組織細胞作為抗原，根據抗原與抗體特異性結合原理，當加入抗HER2的多克隆抗體IgY時，如果組織細胞中含有HER2蛋白，多克隆抗體IgY便會與HER2進行特異性結合，最后通過標記抗體的顯色反應來確定組織細胞內的抗原，從而對HER2進行定位、定性及定量的研究，借此對由HER2過度表達引起的惡性腫瘤進行臨床診斷。