[發明專利]建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法

在審

• 申請號: 201410138851.2
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103881962A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 效梅;安立龍
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

技術領域

本發明涉及建立人類和其它哺乳動物胰腺導管干細胞系的方法，特別涉及一種建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，屬于動物細胞（組織）工程領域。

背景技術

糖尿病（Diabetes?mellitus，DM）是危害人類健康的重大疾病之一，據統計目前全世界糖尿病患者已達3.46億(Am?J?Stem?Cells.2012,1(3):196-204.)，而傳統的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫治該病。近十年來，隨著移植技術的發展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效（N?Engl?J?Med.2000,343(4):230-238.?Diabetes.?2005,?54(7):?2060-2069.?Am?J?Transplant.2008,8(11):2463-2470.?Immune?Netw.?2013,13(6):235-239.）。但是，由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術的應用受到制約。胰腺導管干細胞是存在于胰腺導管組織中的成體干細胞，能自我更新并具有多分化潛能。體外分離克隆胰腺導管干細胞，誘導其分化形成功能性胰島，并移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰腺導管干細胞系，研究胰腺導管干細胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點。國外，Ramiya等（Nat?Med.2000,6(3):278-282.?J?Hepatobiliary?Pancreat?Surg.2002,9(6):?704-709.）首先報道膠原酶消化NOD小鼠胰腺組織，手工分離胰腺導管，消化獲得單個細胞和細胞團，無糖、高氨基酸培養液擴增培養形成單層；體外誘導，這些細胞產生小而圓的胰島祖細胞（islet?progenitor?cells，IPCs），繼續培養，這些小細胞進一步形成胰島（IPC-derived?islets）；RT-PCR擴增表明IPCs和IPC-derived?islets轉錄胰島素Ⅰ、Ⅱ等因子，也表達與胰島發育和分化有關的因子Pdx1、β-半乳糖苷酶和酪氨酸羥化酶等。葡萄糖刺激，IPC-derived?islets釋放insulin；將300個IPC-derived?islets移植在NOD成年小鼠腎囊內，能降低NOD小鼠血糖，抗糖尿病。Bonner-Weir等（Sci?Med.2000,97(14):7999-?8004.?Pediatric?Diabetes.2004,5(Supppl2):16-22.）采用Ricordi分離法，成人胰腺導管插管，向胰尾組織內注入1～2g/LⅤ型膠原酶（2mL/g胰腺組織），并將胰尾放入30℃Hank′緩沖液中，消化20～30min；0.5mm孔徑濾沙過濾，離心，收集組織碎片和細胞；以Histopaque作不連續密度梯度離心，收集位于1.098～1.119g/mL界面間的細胞，分離出胰腺導管上皮細胞；CMRL1066+10%FBS培養液貼壁培養，部分上皮樣細胞形成單層后，換用無血清DMEM/F12+1g/LITS（5mg/Linsulin+5mg/L轉鐵蛋白+5mg/L硒）+2g/L牛血清白蛋白+10mM煙酰胺+10ng/mL角質細胞生長因子+100U/mL青霉素+100ug/mL鏈霉素培養液擴增培養；免疫化學反應顯示上皮樣細胞表達CK19，少量散在細胞表達insulin和Pdx1；體外誘導培養，上皮樣細胞分化形成雙硫腙（dithizone，DTZ）染色陽性，且分泌insulin的胰島細胞團。Rovira等（Proc?Natl?Acad?Sci?USA.2010,107(1):75-80.?Development.2005,?132(16):3767-3776.）無菌取成年小鼠完整胰腺，0.2mg/mL膠原酶消化，500μm和105μm孔徑濾膜過濾，離心，WaymouthsMB752?+10%FBS?+50%RTC+0.1mg/mL胰蛋白酶抑制劑+1μg/mL地塞米松+1000U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素培養液重懸細胞，置于37°C、5%CO_2?培養箱中培養14d；采用ALDH1熒光標記和干細胞鑒定試劑盒，并通過流式細胞儀篩選，獲得來源于小鼠胰腺導管末端/泡心部干細胞；PCR檢測該干細胞表達Sca-1、Sdf1、c-Met、nestin和Sox9基因；體外定向誘導，干細胞分化形成腺泡細胞，產生淀粉酶；分化形成胰島細胞，糖刺激，分泌insulin。Huch等（EMBO?J.2013,32(20):2708-2721.）結扎成年小鼠部分胰腺導管，制備胰腺導管干細胞增殖修復模型。無菌取胰腺組織，0.3mg/mLXI型膠原酶消化，分離獲得單個細胞；篩選去除上皮細胞粘附分子（Epithelial?cell?adhesion?molecule，EpCAM)表達陰性細胞和白細胞分化抗原45、31（cluster?of?differentiation45、31，CD45、31）表達陽性細胞，篩選去除EpCAM陽性和Zn⁺螯合物TSQ（6-methoxy-8-p-toluenesulfonamido-?quilone，TSQ）陽性細胞，再篩選去除insulin啟動子表達陽性細胞后，獲得純度>99.6%的胰腺導管上皮樣干細胞（EpCAM⁺、TSQ^?）；體外培養，這些干細胞已擴增10個月；核型分析，細胞染色體數正常；流式細胞術檢測表達成體干細胞標記物Lgr5；移植在裸鼠腎囊內，干細胞分化形成胰腺導管細胞和胰島內分泌細胞。Lee等（Elife.2013?Nov?19;2:e00940.?doi:10.7554/eLife.00940.）采用去除胰島后的剩余人胰腺組織，0.05%胰蛋白酶、1U/mLdispase依次消化，收集細胞，CD133標記，流式細胞術分選；RT-PCR檢測分選出的細胞共表達CK19，不表達腺泡細胞和胰島細胞標記物，證實分離獲得人胰腺導管細胞；DMEM/F-12+50ng/mLEGF+500ng/mLSpondinI+?50ng/mLFGF10+100ng/mLNoggin+10mM尼克酰胺培養液擴增，人胰腺導管細胞呈對數生長，傳7代；構建Neurog3腺病毒載體，轉染，人胰腺導管細胞轉分化形成胰島細胞，分泌insulin；將誘導胰島移植在NOD成年小鼠腎囊內，糖刺激，分泌人insulin。國內，效梅等（中國科學C輯:生命科學.2008,38(8):699-707.?Science?in?China?Series?C:?Life?Science.2008,51(9):779-788.?分子細胞生物學報.2008,41(6):450-457.?分子細胞生物學報.2008,41(6):457-464.?解剖學報.2009,?40(2):55-58.?中國獸醫學報.2009,29(2):?191-195.）報道Ⅳ型膠原酶消化人胎兒胰腺組織20～40min，收集單個細胞和細胞團，低糖DMEM+3.7g/LNaHCO_3?+10%FBS+0.08g/L青霉素+0.1g/L鏈霉素培養液培養。當原代上皮樣胰腺干細胞長出后，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，傳代。在傳代中逐漸消除成纖維樣細胞和其他細胞，純化上皮樣胰腺干細胞。采用克隆環篩選出典型的單克隆人胰腺干細胞，培養液中添加10ng/mLEGF擴增培養，建立人胎兒胰腺干細胞系。免疫化學反應和RT-PCR檢測該干細胞表達Pdx1、glucagon、nestin及CK19，不表達insulin、CD34、CD44及CD45。β-巰基乙醇體外誘導，分化形成神經細胞，表達NF。煙酰胺誘導，分化形成DTZ染色陽性，分泌insulin和C肽的功能性類胰島。將單克隆人胰腺干細胞體外誘導胰島移植在STZ制備的糖尿病大鼠腎囊內，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長壽命。李娟等（現代生物醫學進展.2009,9(11):2024-2026.）膠原酶消化人胰腺組織，Ficoll密度梯度離心，收集細胞，用含10％FBS的CMRL1066培養液培養，7～10d，較純的鵝卵石樣胰腺導管干細胞擴增至單層，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。取2～3代細胞，熒光免疫化學反應和RT-PCR檢測分離的人胰腺導管干細胞表達CK19、Pdx1和nestin，不表達insulin和glucagon。陳海燕等（南京醫科大學學報:自然科學版.2008,28(3):273-277）V型膠原酶灌注消化成年大鼠胰腺組織，Ficoll密度梯度離心去除胰島，獲得較純的胰腺導管細胞。采用含10%NBS的RPMI1640培養液培養，0.25％胰蛋白酶消化液消化傳代，獲得第2代細胞。熒光免疫化學反應顯示大鼠胰腺導管細胞表達CKl9、Pdx1和nestin，不表達insulin、glucagon。RT-PCR進一步證實該細胞轉錄CKl9、Pdx1和nestin基因。陳旭春等（中華器官移植雜志.2012,33(6):371-375.）V型膠原酶消化分離大鼠胰腺組織，不連續密度梯度離心，初步分離胰腺導管細胞與胰島細胞。采用動力性三維培養技術進行培養，獲得胰腺導管來源干細胞，進行擴增培養、連續傳代和純化，建立細胞系。該細胞是單核細胞，成纖維樣貼壁生長，表達CD29、CD73、CD90和CD105，不表達CD14、CD19、CD34和CD45，證實該大鼠胰腺導管來源干細胞為間充質干細胞。目前，國內尚無建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的報道，建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法還不成熟。本發明建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，將為進一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導管干細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對于研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。