[發明專利]建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法

在審

• 申請號: 201410138851.2
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103881962A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 效梅;安立龍
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

1.建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：包括如下步驟：?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????（1）大鼠胰腺導管原代上皮樣干細胞分離培養?

無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至1mm3，膠原酶消化，Dextron不連續密度梯度離心，收集Dextron分離液處細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，大鼠胰腺導管原代上皮樣干細胞貼壁生長；

（2）大鼠胰腺導管上皮樣干細胞純化??

打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置于胰腺導管上皮樣干細胞區域內，在克隆環孔中消化，收集克隆環中的細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，純化的大鼠胰腺導管上皮樣干細胞克隆性生長；當細胞生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣；

（3）大鼠胰腺導管上皮樣干細胞傳代培養

當純化的大鼠胰腺導管上皮樣干細胞生長至80%融合，加入胰蛋白酶消化液消化，收集的細胞接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，細胞培養液擴增培養；1例大鼠胰腺導管上皮樣干細胞已傳80代；

（4）大鼠胰腺導管上皮樣干細胞冷凍保存

冷凍：用細胞冷凍液稀釋大鼠胰腺導管上皮樣干細胞，分裝于冷凍管，平衡，投入液氮長期冷凍保存；

解凍：從液氮罐中取出大鼠胰腺導管上皮樣干細胞冷凍管，迅速投入37℃水域中解凍，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰腺導管上皮樣干細胞解凍成活率為92%。

2.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：

步驟（1）所述的膠原酶消化是指加入0.1%Ⅳ型膠原酶，在37℃條件下，消化20min。

3.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：步驟（1）所述的收集Dextron分離液處細胞是指收集11%和20%濃度Dextron分離液處細胞。

4.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：步驟（2）所述的消化是指加入0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA消化液，室溫消化3min。

5.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：步驟（3）所述的細胞培養液是指RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF。

6.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：

步驟（4）所述的細胞冷凍液是指80%DMEM+10%DMSO+10%NBS。

7.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的方法，其特征在于：

步驟（4）所述的平衡是指4℃平衡30min，液氮面上懸浮2h。

8.根據權利要求1所述的方法建立的大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系，其特征在于：所述的大鼠胰腺導管上皮樣干細胞系的保藏號為C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏單位：中國典型培養物保藏中心。