[發明專利]奶中一種或多種蛋白的提取方法

無效

• 申請號: 201410138470.4
• 申請日: 2007-05-31
• 公開（公告）號: CN103910779A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 阿蘭·勒雅爾;米歇爾·諾格雷;米歇爾·泰利耶
• 申請（專利權）人: LFB生物科技公司
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 叢芳

技術領域

本發明涉及奶中一種或多種蛋白的提取方法。所述蛋白對所述奶中復合的或非復合的鈣離子具有親和性。

本發明中，復合的或非復合的鈣離子指結合到酪蛋白以形成酪蛋白的膠束膠體結構的磷酸鈣鹽，或者指這些沒有結合到酪蛋白并因此是自由的鹽。這些離子也是溶解在奶中的與上述不同的各種鈣鹽和/或有機的和/或無機鈣復合物。對奶中鈣離子具有親和性的蛋白是指那些自然存在的蛋白，例如乳清蛋白、乳球蛋白以及免疫球蛋白。這些蛋白也指存在于轉基因動物奶中的重組蛋白，例如，血凝因子，尤其是因子Ⅶ、因子Ⅷ和因子Ⅸ。

背景技術

市售藥物的主要部分對應于合成獲得的化學物質。事實上，直到最近，現代醫學高度依賴于利用化學合成生產的藥物，用于疾病的診斷和治療。

然而，蛋白代表攜帶生物信息的分子的實質部分，尤其是大量的激素、生長因子、血凝因子或抗體。

通常，蛋白質為基于氨基酸的聚合物，且大部分具有高分子量，其不能通過化學合成在可接受的成本下獲得。這些用于治療的蛋白質通常從人類或者動物組織或血液，例如活體，通過分離和純化獲得。尤其是從豬胰腺提取的胰島素、從血漿中提取的例如為因子Ⅷ或因子Ⅸ的血凝因子、或者免疫球蛋白。

盡管目前上述蛋白質的制備方法被大量應用，然而，它們具有缺陷。從血小板中提取的一些蛋白，例如為促紅細胞生成素，的低含量使得它們不能足夠量的分離以滿足不斷增長的治療需要。此外，在血漿蛋白的生產過程中，人體內病毒、朊病毒或者其他致病劑的存在需要添加病毒滅活和/或病毒消除的包涵體，以獲得可用于治療的有用產品。

為了克服這些缺陷，遺傳工程被使用。該技術同樣大量應用于合成蛋白中，從一個獨立基因轉移到負責分泌期望蛋白的細胞。從源細胞系統外獲得的這樣的蛋白稱之為《重組》。

根據這一技術，可以使用不同細胞系統。

細菌系統，例如E.coli，大量應用且有效。它們能低成本的生產重組蛋白。然而，這些系統不能用于生產簡單的非糖基化蛋白，其不需要精細折疊處理。

真菌系統同樣應用于分泌蛋白的生產。這些真菌系統的缺陷在于它們是翻譯后修飾的起因，包括，例如，接枝聚糖部分和硫酸基，其能高度影響生產的蛋白的藥代動力學，尤其是添加甘露糖衍生物的不同基團。

使用桿狀病毒的系統可以生產非常不同的蛋白，例如疫苗蛋白或生長激素，但是它們工業化應用不是最優的。

同樣使用哺乳動物培養物以用于重組復合蛋白的生產，例如單克隆抗體。細胞表達系統導致正確的折疊的和修飾的重組蛋白。與生產成本相比，低的產量是其主要缺陷。

這些細胞系統的變體包括實現轉基因植物以用于獲得大量的蛋白。然而，這些系統產生植物-特異性翻譯后修飾，尤其是在生產的蛋白中添加了高度致免疫木糖殘基，因此限制了它們在治療應用中的用途。

前面提到的細胞系統的替代包括使用轉基因動物以用于生產重組疫苗或者復合治療蛋白。因此，獲得的蛋白表現出與人類接近的糖基化，且能被正確的折疊。這些復合蛋白并不僅由一個簡單的例如為生長激素的多肽鏈組成，它們組裝成氨基酸后用不同的途徑被修飾，尤其是通過特異性斷裂、糖基化和羧甲基化。大部分情況下，通過細菌細胞或酵母不能實現修飾。另一方面，轉基因動物能同時結合細菌細胞系統中遇到的表達水平以及細胞培養物中獲得的翻譯后修飾，同時與使用細胞表達系統相比，降低了制造成本。

來自于轉基因動物的生物材料中，奶是研究的目標，其被考慮為非常符合要求的分泌重組蛋白的來源。

從轉基因動物的奶中生產的重組蛋白，能很容易的通過將編碼所感興趣蛋白的基因接枝到一個負責合成奶蛋白的基因的調控區而獲得，其會指導特別是在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。

例如，EP0527063描述了在轉基因哺乳動物的奶中感興趣蛋白的生產。提到了通過抗乳血清的啟動子來控制編碼感興趣蛋白的基因的表達。

另外的專利申請或者專利描述了抗體（EP0741515）、膠原（WO96/03051）、人類因子Ⅸ（US6046380）、以及因子Ⅷ/血管性血友病因子復合物（EP0807170）在轉基因哺乳動物的奶中的制備。

盡管這些方法在蛋白表達方面有滿意的結果，但是使用奶作為重組蛋白的源具有缺陷。主要缺陷一方面在于難以從奶中提取獲得滿意的產量，另一方面在于接下來難以提純。