[發(fā)明專利]一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A的熱穩(wěn)定性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410137657.2
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN103966186A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃和;江凌;李曉彤;李霜;胡燚
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12R1/125
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的方法。

背景技術(shù)

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，是一種特殊的酯鍵水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反應(yīng)，生成脂肪酸和甘油、甘油單酯或二酯。枯草芽孢桿菌分泌的脂肪酶A是一類在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景的生物催化劑。枯草芽孢桿菌脂肪酶是最小的α/β折疊脂肪酶，且缺乏多數(shù)脂肪酶都具有的α螺旋形成的“蓋子結(jié)構(gòu)”，從而沒有其它脂肪酶具有的界面激活效應(yīng)。但是枯草芽孢桿菌脂肪酶A對溫度極其敏感，在溫度超過40℃時，其酶活會急劇下降。

酶的熱穩(wěn)定性是酶的重要屬性之一，熱穩(wěn)定性酶具有提高化學(xué)反應(yīng)速率、簡化工藝、降低成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量、活性穩(wěn)定、耐貯藏等優(yōu)點。因而尋找耐溫性酶，提高酶的熱穩(wěn)定性一直是生產(chǎn)和科研關(guān)注的熱點。雖然目前已經(jīng)有大量的關(guān)于酶熱穩(wěn)定性改造研究的報道，但是傳統(tǒng)的理性設(shè)計方法受到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系復(fù)雜性的限制，而非理性設(shè)計方法則需要面臨篩選容量大、過程復(fù)雜等難題，這兩種方法各自的缺點在一定程度上限制了蛋白質(zhì)改造領(lǐng)域的工作進展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，結(jié)合脯氨酸效應(yīng)提出一種高效的計算機輔助篩選提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的方法。

本發(fā)明的技術(shù)目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：基于脯氨酸效應(yīng)提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A（Bacillus subtilis lipase A， PBD: 1I6W）熱穩(wěn)定性的方法，包括如下步驟：

1）獲取枯草芽孢桿菌脂肪酶A晶體結(jié)構(gòu)，通過分子動力學(xué)分析其蛋白結(jié)構(gòu)中柔性較高的Loop區(qū)域；

2）結(jié)合脯氨酸理論效應(yīng)分析確定位于柔性較高Loop區(qū)域的甘氨酸（Gly）殘基；

3）基于對酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認知，采用分子動力學(xué)模擬技術(shù)解析將相關(guān)甘氨酸位點置換為脯氨酸后對枯草芽孢桿菌脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響；

4）構(gòu)建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變體并驗證其熱穩(wěn)定性，獲得熱穩(wěn)定性得到提高的枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株。

優(yōu)選的，步驟1）所述的獲取枯草芽孢桿菌脂肪酶A晶體結(jié)構(gòu)并通過分子動力學(xué)分析其蛋白結(jié)構(gòu)中柔性較高的Loop區(qū)域的方法為：通過檢索蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein data bank)RCSB數(shù)據(jù)庫得到枯草芽孢桿菌脂肪酶A（PBD: 1I6W）的晶體結(jié)構(gòu)，使用軟件Pymol0.9分析枯草芽孢桿菌脂肪酶A的三維結(jié)構(gòu),利用分子動力學(xué)方法，得到枯草芽孢桿菌脂肪酶A的Rmsf（Root mean square fluctuation）值，從而確定枯草芽孢桿菌脂肪酶A柔性較大的區(qū)域。

優(yōu)選的，步驟2）所述的結(jié)合脯氨酸效應(yīng)分析確定柔性較高區(qū)域的甘氨酸（Gly）殘基的方法為：根據(jù)步驟1）得到的枯草芽孢桿菌脂肪酶A的RMSF圖，利用Pymol可視化軟件，確定位于柔性較高Loop區(qū)域的Gly殘基作為突變位點突變?yōu)镻ro，分別為Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro。

優(yōu)選的，步驟3）所述的采用分子動力學(xué)模擬技術(shù)解析將相關(guān)甘氨酸位點置換為脯氨酸后對穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的影響的方法為：通過分析均方根偏差RMSD（Root Mean Square Deviation）與均方根漲落RMSF（Root Mean Square Fluctuation）參數(shù)，來分析引入的Pro突變位點對枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的貢獻，確定得到提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的重要氨基酸位點是Gly52Pro和Gly158Pro。

優(yōu)選的，分子動力學(xué)模擬技術(shù)具體為：所有動力學(xué)模擬均采用GROMACS4.5.4進行，體系在中性條件下，溶劑模型SPC，力場為GROMOS9653a6，溫度為400K，相應(yīng)地抗衡離子中和體系電荷；體系首先采用最速下降法能量最小化（Steepest Descent）進行優(yōu)化；然后固定蛋白，采用壓力（Parrinello-Rahman）與溫度（V-rescale）進行500 ps約束優(yōu)化；最后進行分子動力學(xué)模擬，放松蛋白，時間步長為2 fs，模擬時間為10 ns。體系每隔1 ps收集一次數(shù)據(jù)。