[發明專利]一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A的熱穩定性的方法

有效

• 申請號: 201410137657.2
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN103966186A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 黃和;江凌;李曉彤;李霜;胡燚
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12R1/125
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A的熱穩定性的方法，其特征在于包括如下步驟：

1) 獲取枯草芽孢桿菌脂肪酶A晶體結構，通過分子動力學分析其蛋白結構中柔性較高的Loop區域；

2) 結合脯氨酸理論效應分析確定位于柔性較高Loop區域的甘氨酸殘基；

3) 基于對酶結構與功能關系的認知，采用分子動力學模擬技術解析將相關甘氨酸位點置換為脯氨酸后對枯草芽孢桿菌脂肪酶A蛋白結構穩定性的影響；

4) 構建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變體并驗證其熱穩定性，獲得熱穩定性得到提高的枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1）所述的獲取枯草芽孢桿菌脂肪酶A晶體結構并通過分子動力學分析其蛋白結構中柔性較高的Loop區域的方法具體為：通過檢索蛋白數據庫RCSB數據庫得到枯草芽孢桿菌脂肪酶A的晶體結構，使用軟件Pymol0.9分析枯草芽孢桿菌脂肪酶A的三維結構，利用分子動力學方法，得到枯草芽孢桿菌脂肪酶A的Rmsf值，從而確定枯草芽孢桿菌脂肪酶A柔性較大的區域。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2）所述的結合脯氨酸理論效應分析確定位于柔性較高Loop區域的甘氨酸殘基的方法是：根據步驟1）得到的枯草芽孢桿菌脂肪酶A的RMSF圖，利用Pymol可視化軟件，結合脯氨酸效應理論,確定位于柔性較高Loop區域的Gly殘基作為突變位點突變為Pro，分別為Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3）所述的采用分子模擬技術解析將相關甘氨酸位點置換為脯氨酸后對枯草芽孢桿菌脂肪酶A蛋白結構穩定性的影響的方法：通過分析均方根偏差RMSD與均方根漲落RMSF參數，來分析引入的Pro突變位點對枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩定性的貢獻，確定得到提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩定性的重要氨基酸位點是Gly52Pro和Gly158Pro。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于分子動力學模擬技術具體為：所有動力學模擬均采用GROMACS4.5.4進行，體系在中性條件下，溶劑模型SPC，力場為GROMOS9653a6，溫度為400K，相應地抗衡離子中和體系電荷；體系首先采用最速下降法能量最小化（Steepest Descent）進行優化；然后固定蛋白，采用壓力Parrinello-Rahman，與溫度V-rescale進行500 ps約束優化；最后進行分子動力學模擬，放松蛋白，時間步長為2 fs，模擬時間為10 ns；體系每隔1 ps收集一次數據。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟4）所述的分子生物學構建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株的方法是采用全質粒擴增的方式進行突變：首先，設計分別含有Gly52Pro和Gly158Pro的引物，用primSTAR對全質粒進行擴增，突變質粒分別轉入DH5α，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，再轉接到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中過夜培養；提取質粒，并轉入BL21（DE3），涂布平板，構建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變菌BL21-pET22b-LipA。