[發明專利]一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養方法

有效

• 申請號: 201410137036.4
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103898025B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 劉曉艷;黃大野;楊自文;閔勇;王開梅;萬中義;曹春霞;周榮華;江愛兵
• 申請（專利權）人: 湖北省生物農藥工程研究中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01P5/00;C12R1/07
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

技術領域

本發明涉及一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養方法。?

背景技術

據FAO保守估計，全世界每年因線蟲危害對糧食和纖維作物造成的損失大約為12%，對蔬菜、花生、煙草和某些果樹造成的損失要超過20%，甚至達到50%。據權威專家報道，植物寄生線蟲每年造成世界農業生產的損失約1500億美元。我國每年因線蟲造成的損失大約35億美元。?

目前對植物有害的線蟲約有3000多種，而在我國發現的有40多種，其中對作物危害最嚴重的線蟲之一是根結線蟲。根結線蟲蟲體微小，生活在植物體內或土壤中，會隨著雨水、勞事操作及病株的轉移而轉移，防治極為困難。?

防治植物寄生線蟲病害的主要方法有化學防治和生物防治。化學藥劑大部分為劇毒藥物，嚴重污染環境。生物防治是利用線蟲的天敵來控制蟲口數量和限制線蟲引起的損失，且對人、動物和環境均相對安全，應用前景廣闊。生物防治中目前應用最廣泛的是蘇云金芽胞桿菌（Bacillus?thuringiensis,簡稱Bt），此外還有穿刺巴氏桿菌（Psteuriapenetrans）、假單胞桿菌（Pseudomonas?spp.）以及近年發現的堅強芽胞桿菌（Bacillus?firmus）等。?

早在1972年，Prasad等首先發現Btβ-外毒素對根結線蟲(Root-knot?nematode,RKN)的卵和幼蟲有很高的活性。之后發現Btβ--外毒素對香蕉穿孔線蟲(Radopholus?similis)、大豆胞囊線蟲和酸醬線蟲(Panagrellus?redivivus)等線蟲具有很高的殺蟲活性(Ignoff?et?al.,1977;Devidas?et?al.,1988)。20世紀80年代中期Bone等發現Bt庫斯塔克亞種(subsp.kurstaki)和以色列亞種(subsp.israelensis)對動物寄生線蟲蛇形毛圓線蟲(Trichostronglus?colubriformis)的卵和幼蟲有很高的殺蟲活性，1988年美國Mycogen公司發現Bt晶體蛋白對根結線蟲屬(Meloidogyne?spp.)、矮化線蟲屬(Tylenchs?spp.)、短體線蟲屬(Pratylenchus?spp.)和滑刃線蟲屬(Aphlenchoides?spp.)等植物。美國Mycogen公司篩選到很多對植物寄生線蟲有殺蟲活性的Bt菌株，同時也申請了?專利。1993年我們初步篩選到9株對植物寄生線蟲有殺蟲活性的Bt菌株，這些Bt菌株對甘薯莖線蟲(Ditylenchus?destructor)、北方根結線蟲(M.hapla)、和苧麻短體線蟲(P.scribneri)有很高殺蟲活性，其中已申請國家專利的菌株是YBT-1532(ZL00-1-16062.1)(余子全等，2007b)。?

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌及其培養方法。?

本發明目的的實現方式為，一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌,蘇云金芽胞桿菌NBIN-863Bacillus?thuringiensis?NBIN-863，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，保藏中心編號CCTCC?NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。?

一種殺南方根結線蟲的蘇云金芽胞桿菌的培養方法，具體步驟如下：?

1）取安徽省九華山附近，東經117度29分,北緯30度39分位置的土壤樣品1g，在實驗室用1ml無菌水懸浮，按照10^-3、10^-4、10^-5、10^-6濃度進行稀釋涂平板，用LB固體培養液28℃恒溫培養箱中倒置培養24h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，28℃條件下培養24h；?

LB固體培養液配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，瓊脂粉20g，溶于1L蒸餾水中，121℃，30min，濕熱滅菌；?

2）將重復分離純化到的單菌落接種到5ml?LB液體培養基搖瓶中，28℃，200rpm，培養36h，?

所述LB液體培養基配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，溶于1L蒸餾水中，121℃，30min，濕熱滅菌；?

3）先用去離子水配置甘油，121℃濕熱滅菌30min，水：甘油體積比=1:1；?