[發(fā)明專利]一種殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌及其培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410137036.4
• 申請(qǐng)日: 2014-04-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103898025B
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉曉艷;黃大野;楊自文;閔勇;王開(kāi)梅;萬(wàn)中義;曹春霞;周榮華;江愛(ài)兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01P5/00;C12R1/07
• 代理公司: 武漢開(kāi)元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

1.一種殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌，其特征在于殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌NBIN-863Bacillus?thuringiensis?NBIN-863，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏中心編號(hào)CCTCC?NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。?

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌，其特征在于殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌菌株形態(tài)：平板上生長(zhǎng)的單菌落為乳白色雪花狀，表面粗糙，生長(zhǎng)24h電鏡下觀察為桿狀，生長(zhǎng)36h后為染不上色的芽胞和染上色的菱形晶體；生長(zhǎng)48h后上清液產(chǎn)生6種蛋白，其中3種為殺蟲(chóng)晶體蛋白，分別是Cry9Aa-like蛋白(98kDa)、Cry2Aa蛋白(69kDa)及Cry1Ac蛋白(130kDa)。?

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌，其特征在于具有殺南方根結(jié)線蟲(chóng)活性。?

4.培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的一種殺南方根結(jié)線蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌的方法，其特征在于具體步驟如下：?

1)取安徽省九華山附近，東經(jīng)117度29分,北緯30度39分位置的土壤樣品1g，在實(shí)驗(yàn)室用1ml無(wú)菌水懸浮，按照10^-3、10^-4、10^-5、10^-6濃度進(jìn)行稀釋涂平板，用LB固體培養(yǎng)液28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，28℃條件下培養(yǎng)24h；?

LB固體培養(yǎng)液配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，瓊脂粉20g，溶于1L蒸餾水中，121℃，30min，濕熱滅菌；?

2)將重復(fù)分離純化到的單菌落接種到5ml?LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，28℃，200rpm，培養(yǎng)36h，?

所述LB液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g，溶于1L蒸餾水中，121℃，30min，濕熱滅菌；?

3)先用去離子水配置甘油，121℃濕熱滅菌30min，水：甘油體積比＝1:1；?

4)將步驟2)培養(yǎng)了36h后的500μl菌液與滅菌的500μl50％的甘油等體?積混合，混勻后放于-80℃冰箱中保藏；?

5)將從LB平板上分離純化到的單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)液中，28℃，200rpm，培養(yǎng)48h后，進(jìn)行涂片、固定、結(jié)晶紫染色后，在光學(xué)顯微鏡油鏡鏡頭下進(jìn)行形態(tài)觀察為蘇云金芽胞桿菌菌株。?