[發明專利]一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201410136643.9
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103887030A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 任宇紅;魏東芝;倪克奉;楊劍冰
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: H01F1/11
• 分類號: H01F1/11;C07K1/22;C12N11/14;C12N11/08
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用。

背景技術

固定金屬離子親和色譜（IMAC）是近30年來發展起來的一種新型高效的蛋白質親和分離技術，它主要通過材料表面的配基螯合銅、鎳、鈷或鋅離子，利用蛋白質表面的一些氨基酸殘基，如組氨酸、色氨酸或半胱氨酸能和這些離子發生較強的配位作用從而實現分離蛋白的目的。和其他蛋白純化的方法相比，IMAC技術具有配基穩定性高、可重復使用且再生成本低、對目標蛋白選擇性好且吸附量大、吸附與洗脫條件溫和不影響蛋白活性等優點，尤其對帶有6個組氨酸標簽融合蛋白的分離純化具有很好的效果。因此該技術逐漸成為了蛋白質分離純化領域最有效、應用最廣的技術之一。

目前的IMAC多采用傳統的柱層析技術，仍然具有以下的缺點：樣品需要預處理去除固體顆粒以防堵塞層析柱，分離過程操作繁瑣、耗時長、成本高，此外存在擴散阻力導致分離效率下降。近年來快速發展的磁性親和納米技術給蛋白的分離純化帶來了革命性的發展，其特有的超順磁特性簡化了固液相分離過程，省去離心、過濾等繁雜的操作。納米尺寸的粒徑提供了極大的比表面積，提升目的蛋白的吸附量。在固定化酶研究領域，磁性親和納米材料可以作為載體實現酶的一步純化固定化，簡化了固定化酶制備過程。此外，將酶固定在磁性的材料上，在應用的過程中可以通過磁分離將催化劑從反應液中迅速分離，簡化連續操作過程，節省成本。

雖然現有技術中已公開了一種用于組氨酸標簽蛋白純化的磁性親和磁珠，但是這種材料的制備過程復雜，需要多步化學的修飾過程，此外，商品化的產品價格較高，導致實際應用并不廣泛。

近年來，多巴胺作為一種仿生粘附物質受到了密切的關注。研究發現多巴胺在弱堿性條件下能自聚形成聚多巴胺并包裹在幾乎任何材料的表面。此外，在多巴胺自聚的同時，其所含有的鄰苯二酚基團能與金屬離子形成穩定的絡合物。在生物技術領域，組氨酸標簽融合蛋白系統的應用更加廣泛，而到目前為止都還沒出現將多巴胺用于組氨酸標簽蛋白純化的相關研究。并且，在組氨酸標簽蛋白的固定化領域，到目前為止也還沒有出現一種可實現對組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化的簡單的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒及其制備方法和應用，從而解決現有技術中的用于組氨酸標簽蛋白純化的磁性親和材料制備過程復雜，產品價格較高的缺陷，以及現有技術中缺少一種簡單即可實現對組氨酸標簽蛋白的一步純化固定化的方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

提供一種用于純化并固定化組氨酸標簽蛋白的磁性親和納米顆粒，包括：四氧化三鐵納米顆粒和包裹于所述四氧化三鐵納米顆粒外部的聚多巴胺涂層，所述聚多巴胺涂層表面螯合有鎳離子。

所述磁性親和納米顆粒的粒徑為200-300納米。其中，四氧化三鐵納米顆粒的粒徑大約為150-250納米，聚多巴胺涂層包裹于四氧化三鐵納米顆粒外部，其厚度在25納米左右。

根據本發明所提供的磁性親和納米顆粒具有較大的比表面積，提高了蛋白的吸附效率和吸附量；利用四氧化三鐵納米顆粒超順磁的特性可簡化蛋白分離純化以及固定化的流程，同時可簡化固定化酶后續使用的流程；利用聚多巴胺富有的鄰苯二酚基團螯合鎳離子，可實現對組氨酸標簽蛋白的特異性結合。

本發明中四氧化三鐵納米顆粒優選的制備方法如下：將氯化鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉和乙二醇按照摩爾比1：0:17：36.5：89.5混合，攪拌溶解后，加熱至200℃，反應12小時，冷卻后通過磁分離，并用乙醇和水去清洗得到四氧化三鐵納米顆粒。

本發明中的磁性親和納米顆粒的制備方法包括以下步驟：1）提供Tris-HCl緩沖液配置多巴胺溶液，加入四氧化三鐵納米顆粒，攪拌，通過磁分離得到聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒；2）提供鎳離子溶液，將步驟1）中制備得到的聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒分散在所述鎳離子溶液中，攪拌，通過磁分離獲得所述磁性親和納米顆粒。

優選地，步驟1）中所述多巴胺溶液的濃度為0.1-5mg/mL，加入所述四氧化三鐵納米顆粒的濃度為0.5-5mg/mL（優選1mg/mL），反應時間為6-12小時，步驟2）中所述鎳離子溶液的鎳離子濃度20-200mM（優選100mM），加入聚多巴胺修飾的四氧化三鐵納米顆粒濃度為0.5-5mg/mL（優選1mg/mL），攪拌時間為1-6h。