[發明專利]甜菜胚珠切割透明制片方法

無效

• 申請號: 201410136044.7
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103868779A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 劉麗萍;王艷;孫元
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一種胚珠切割透明制片方法。

背景技術

從胚胎學角度觀察植物胚囊的變化以了解其發生機制，是植物學中常用的方法。被子植物的雌配子體也稱胚囊，甜菜胚囊位于子房及胚珠多層細胞的包圍之中，甜菜胚珠是厚珠心（6-7層），給研究大孢子母細胞發生發育的工作帶來很大的難度。

石蠟切片法是研究植物胚囊最常用的方法之一，效果好，可是工作量極大且實驗周期較長。該方法包埋材料完整，為了觀察胚囊的發育情況，找到大孢子母細胞，需要連續切片、費時費力，往往選一張好的制片需要淘汰成千上萬張制備好的切片，工作量極大，給實驗帶來了不小的難度。

發明內容

本發明是要解決現有觀察甜菜胚囊的方法處理量大，費時、費力的問題，提供一種甜菜胚珠切割透明制片方法。

本發明甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步驟進行：

一、取樣及固定：取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后將甜菜花蕾浸泡在體積濃度為70%的乙醇溶液中，貯存在4℃冰箱中備用，其中每100mL?FPA固定液由5mL福爾馬林、5mL丙酸和90mL體積濃度為50%的乙醇溶液組成；

二、整體染色：將步驟一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋紅染色液中進行整體染色，染色時間為4～5d，染色后用溶液A浸泡5～8分鐘，再用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗至呈現透明的紅色；

三、然后用解離液解離，解離時間為5～10min，再用蒸餾水沖洗2～3次；

四、把步驟三解離后的甜菜花蕾放置在培養皿內，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來，然后在距胚珠珠孔端1/3處對胚珠進行切割，保留珠孔端的1/3部分；

五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴一滴透明劑，然后在透明劑中滴一滴硼砂洋紅染色液，靜置2～3min；

六、制片：胚珠透明染色后蓋上蓋玻片，用記號筆在蓋玻片上做一標記確認株孔端的方位，壓片排除蓋玻片內的氣泡，在已做過標記的珠孔方向敲擊，即完成制片。

本發明的有益效果：

（1）本發明方法是利用解剖鏡直接剝離胚囊分離胚珠，并將分離出來的胚珠進行再次切割，只保留珠孔端一小部分進行制片，胚珠其余大部分被廢棄掉，大大減少了視野下胚珠體細胞的數量，增加了觀察大孢子母細胞的準確度，極大的減少了工作量，更易于找到大孢子母細胞。

（2）本發明的方法簡便易行，不用太多儀器設備，解剖鏡和普通光學顯微鏡即可進行分離和觀察。

（3）本發明的方法所用的解離液比酶解法用的果膠酶、纖維素酶成本低得多，鹽酸、酒精1:1即可達到解離目的，且解離效果好，有效降低了實驗成本。

（4）本發明方法的效果好，易于操作和掌握，降低了制片難度，提高了工作效率，省時省力。

此方法也同樣適用于萬壽菊（Tagetes?erecta?L）、矮牽牛（Petunia?hybrida?Vilm）等其它花卉植物。

附圖說明

圖1為實施例中觀察到的甜菜大孢子母細胞照片；圖2為實施例中觀察到的甜菜的單核胚囊照片；圖3為實施例中觀察到的甜菜二核胚囊的早期照片。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式甜菜胚珠切割透明制片方法，按以下步驟進行：

一、取樣及固定：取甜菜的花蕾于FPA固定液中固定24h，然后將甜菜花蕾浸泡在體積濃度為70%的乙醇溶液中，貯存在4℃冰箱中備用，其中每100mL?FPA固定液由5mL福爾馬林、5mL丙酸和90mL體積濃度為50%的乙醇溶液組成；

二、整體染色：將步驟一固定后的甜菜花蕾浸泡在硼砂洋紅染色液中進行整體染色，染色時間為4～5d，染色后用溶液A浸泡5～8分鐘，再用體積濃度為70%的乙醇溶液沖洗至呈現透明的紅色；

三、然后用解離液解離，解離時間為5～10min，再用蒸餾水沖洗2～3次；

四、把步驟三解離后的甜菜花蕾放置在培養皿內，用解剖針在解剖鏡下將胚珠從子房中分離出來，然后在距胚珠珠孔端1/3處對胚珠進行切割，保留珠孔端的1/3部分；

五、將分離切割后留下的株孔端1/3部分放在載玻片上，滴一滴透明劑，然后在透明劑中滴一滴硼砂洋紅染色液，靜置2～3min；

六、制片：胚珠透明染色后蓋上蓋玻片，用記號筆在蓋玻片上做一標記確認株孔端的方位，壓片排除蓋玻片內的氣泡，在已做過標記的珠孔方向敲擊，即完成制片。