[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器及制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410135513.3
• 申請(qǐng)日: 2014-04-04
• 公開（公告）號(hào): CN104977332A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁高峰;孫海燕;陳小娥;唐文艷;張曉娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N27/26
• 分類號(hào): G01N27/26;G01N27/327;G01N27/30
• 代理公司: 寧波誠(chéng)源專利事務(wù)所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)貝類毒素大田軟海綿酸的生物傳感器及制備方法。

背景技術(shù)

大田軟海綿酸（okadaic?acid,OA），一種小分子海洋聚醚類毒素，是分布最廣、發(fā)病率最高的海洋毒素之一，常蓄積于貝類等海洋生物體內(nèi)，可經(jīng)食物鏈引發(fā)多種以腹瀉為主要特征的食物中毒，能導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸功能紊亂，中毒癥狀極易與細(xì)菌性胃腸炎混淆。大田軟海綿酸中毒后無特效藥救治，沿海地區(qū)時(shí)有誤食腹瀉性貝類毒素污染的貽貝等而引發(fā)中毒，嚴(yán)重影響了人們的身體健康和海產(chǎn)品的開發(fā)利用。因此，建立快速、靈敏和可靠的大田軟海綿酸的檢測(cè)方法以及檢測(cè)設(shè)備對(duì)保障海產(chǎn)品安全尤為重要。

目前大田軟海綿酸的生物檢測(cè)方法中常用的有小鼠生物法和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（ELISA）等，其中小鼠生物法比較直觀，可直接判斷該樣品是否可供使用，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、個(gè)體差異大，不能確定毒素的組成成分，定量困難，假陽性率高、重現(xiàn)性差。ELISA法具有較高的敏感度，但ELISA法中抗體往往只針對(duì)主要成分，其類似物可能會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而出現(xiàn)假陽性或?qū)Χ拘缘墓烙?jì)不準(zhǔn)確，而且單克隆抗體的制備困難，試劑盒價(jià)格昂貴，我國(guó)目前尚沒有商品化ELISA試劑盒可售。

申請(qǐng)?zhí)枮閆L201010266834.9（授權(quán)公告號(hào)為CN101975768B）的中國(guó)發(fā)明專利《腹瀉性貝類毒素檢測(cè)方法》中公開了一種檢測(cè)大田軟海綿酸的方法，該方法通過建立大田軟海綿誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍，同時(shí)選擇與腹瀉性貝類毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一種或幾種作用HL-7702肝細(xì)胞，通過檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性。該方法與小鼠生物法相比具有符合3R原則、靈敏度高、特異性較好、重復(fù)性好以及樣品提取簡(jiǎn)便，基質(zhì)效應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)；與ELISA法相比具有特異性較好，靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)，但該方法中以細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，培養(yǎng)周期和成本較高，且檢測(cè)結(jié)果不直觀，不適應(yīng)快速檢測(cè)的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性高、檢測(cè)周期短以及成本低的用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器。

本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述生物傳感器的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器，包括絕緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)，其特征在于，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括蛋白磷酸酶2A（PP2A酶）以及電子傳遞體。

所述電子傳遞體為對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽在PP2A作用下產(chǎn)生對(duì)硝基苯和磷酸鹽離子，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽的去磷酸化反應(yīng)可以電化學(xué)信號(hào)記錄。

作為優(yōu)選，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對(duì)電極為石墨電極，Ag/AgCl電極是重現(xiàn)性和穩(wěn)定性最好的參比電極之一，對(duì)電極在三電極系統(tǒng)中僅起到與工作電極形成回路，以使電極系統(tǒng)中電流通過的作用，因此選擇較穩(wěn)定的石墨作為對(duì)電極。

上述技術(shù)方案中用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器的制備方法中所述PP2A酶通過光交聯(lián)法或瓊脂糖包埋法固定在所述工作電極上。

所述光交聯(lián)法的具體步驟為：

（1）將PP2A酶溶解在pH8～8.7的緩沖液A中制成1～2個(gè)單位/ul的酶溶液，在該酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶與所述PVA-AWP的質(zhì)量比為1～2:1，均質(zhì)后形成固定溶液，所述緩沖液A包含Tris–HCl、EDTA以及MgCl₂，所述1單位PP2A酶為在25℃下1min內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；

（2）然后滴加2.5～3.5ul所述固定溶液（包含1-3個(gè)單位的PP2A酶）至工作電極表面，3～5℃下在功率為12～15W的日光燈下照射3～6h；

（3）光照后，3～5℃下干燥12～24h，干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，將制得的固定化PP2A酶電極在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

作為優(yōu)選，上述緩沖液A包含30mM?Tris–HCl、2mM?EDTA和20mM?MgCl₂，pH值為8.4。

所述瓊脂糖包埋法的具體步驟為：