[發(fā)明專利]一種用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器及制備方法

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• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN104977332A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設計）人: 袁高峰;孫海燕;陳小娥;唐文艷;張曉娟
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/327;G01N27/30
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛(wèi)

1.一種用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器，包括絕緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對電極的電極系統(tǒng)，其特征在于，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括蛋白磷酸酶2A（PP2A酶）以及電子傳遞體。

2.如權利要求1所述的用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器，其特征在于，所述電子傳遞體為對硝基苯磷酸二鈉鹽。

3.如權利要求1或2所述的用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器，其特征在于，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為石墨電極。

4.一種如權利要求1所述的用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述PP2A酶通過光交聯(lián)法或瓊脂糖包埋法固定在所述工作電極上。

5.如權利要求4所述的用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述光交聯(lián)法包括以下步驟：

（1）將PP2A酶溶解在pH8～8.7的緩沖液A中制成1～2個單位/ul的酶溶液，在該酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶與所述PVA-AWP的質量比為1～2:1，均質后形成固定溶液，所述緩沖液A包含Tris–HCl、EDTA以及MgCl₂，所述1單位PP2A酶為在25℃下1min內裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；

（2）然后滴加2.5～3.5ul所述固定溶液至工作電極表面，3～5℃下在功率為12～15W的日光燈下照射3～6h；

（3）光照后，3～5℃下干燥12～24h，干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，將制得的固定化PP2A酶電極在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

6.如權利要求5所述的用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述緩沖液A包含30mM?Tris–HCl、2mM?EDTA和20mM?MgCl₂。

7.如權利要求4所述的用于檢測大田軟海綿酸的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述瓊脂糖包埋法包括以下步驟：

（1）將0.1～0.2g瓊脂糖加入到50～100ml?pH為8～8.7的Tris–HCl緩沖液中，55～65℃加熱4～6min，充分溶解后得瓊脂糖溶液，待該瓊脂糖溶液降溫至20～27℃時，將PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成混合液，該混合液中PP2A酶的濃度為1～2個單位PP2A酶/ul，其中所述1單位PP2A酶為在25℃下1min內裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；

（2）上述混合液3～5℃放置11～13h后，取2.5～3.5ul滴涂于所述工作電極表面，室溫下干燥成膜5～6h；

（3）干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，將制得的固定化PP2A酶電極在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>