[發(fā)明專(zhuān)利]CRISPR?Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特異性sgRNA

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410134461.8
• 申請(qǐng)日: 2014-04-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103911376B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳麗;黃行許
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黃行許
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12N15/85;A61K48/00;A61P31/20
• 代理公司: 北京迎碩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11512
• 代理人: 張群峰,呂良

1.在CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特異性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA，其特征為：

（1）所述sgRNA在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶序列符合5’-GGN(19)GG、5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG的序列排列規(guī)則；

（2）所述sgRNA在HBV?cccDNA的靶向位點(diǎn)位于S蛋白的ORF；

（3）所述sgRNA在HBV?cccDNA的上的靶序列是唯一的。

2.如權(quán)利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特異性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA，其特征為：其序列如序列表SEQ?ID?NO.?30-33任意一條序列所示。

3.CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征為包括如下步驟：

（1）權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的sgRNA，在其對(duì)應(yīng)DNA序列的5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已經(jīng)有1或者2個(gè)G，那么就對(duì)應(yīng)的省略1或者2個(gè)G，合成得到正向寡核苷酸即Forward?oligo；權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的sgRNA，獲得其對(duì)應(yīng)DNA序列的互補(bǔ)鏈，并且在互補(bǔ)鏈的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse?oligo；將合成的1對(duì)互補(bǔ)的sgRNA寡聚核苷酸的forward?oligo和reverse?oligo成對(duì)變性、退火，退火之后形成可以連入U(xiǎn)6真核表達(dá)載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸；

（2）線性化序列如序列表SEQ?ID?NO.?12所示的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒；將退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒；?pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并涂Amp+平板，挑選陽(yáng)性克隆并用序列如序列表SEQ?ID?NO.?11所示的通用引物U6測(cè)序的方法鑒定出陽(yáng)性克隆；37°C搖床搖陽(yáng)性克隆菌過(guò)夜并用AxyPrep?Plasmid?Miniprep?Kit（AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒；

（3）用脂質(zhì)體裝載pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒和序列為SEQ?ID?NO.?13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染攜帶乙型肝炎病毒cccDNA的細(xì)胞；

（4）用T7EN1?酶切檢測(cè)和TA克隆測(cè)序確認(rèn)乙型肝炎病毒cccDNA已經(jīng)被敲除。

4.如權(quán)利要求3所述的CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征為：步驟（3）所述的脂質(zhì)體為L(zhǎng)ipofectamine??2000?Transfection?Reagent。

5.如權(quán)利要求4所述的CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征為：步驟（1）所述的sgRNA其序列為序列表SEQ?ID?NO.?30-33任意一條所示，分別對(duì)應(yīng)的步驟（2）和（3）所述的pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒的序列為序列表SEQ?ID?NO.?16-19任意一條序列所示，即sgRNA序列為SEQ?ID?NO.?30對(duì)應(yīng)的pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒為SEQ?ID?NO.?16，sgRNA序列為SEQ?ID?NO.?31對(duì)應(yīng)的pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒為SEQ?ID?NO.?17，sgRNA序列為SEQ?ID?NO.?32對(duì)應(yīng)的pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒為SEQ?ID?NO.?18，sgRNA序列為SEQ?ID?NO.?33對(duì)應(yīng)的pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒為SEQ?ID?NO.?19。

6.在如權(quán)利要求5所述的CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法中用到的pGL3-U6-HBV?sg質(zhì)粒，其特征為序列如序列表SEQ?ID?NO.?16-19任意一條所示。