[發(fā)明專利]CRISPR?Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特異性sgRNA

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410134461.8
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103911376B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳麗;黃行許
• 申請（專利權(quán)）人: 黃行許
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85;A61K48/00;A61P31/20
• 代理公司: 北京迎碩知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙)11512
• 代理人: 張群峰,呂良

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說涉及CRISPR-Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法。?

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒（Hepatitis?B?VIRUS,?HBV）屬于嗜肝DNA病毒科，是引發(fā)病毒性乙型肝炎的病原體。全球約1/3的人曾感染過HBV，慢性HBV感染者約有3-4億人，其中25%-40%人死于HBV感染相關(guān)疾病，HBV是全球第九大致死性疾病。?我國屬于HBV感染的高流行區(qū)，一般人群的乙肝病毒感染標志，乙肝病毒表面抗原（hepatitis?B?surface?antigen，HBsAg）陽性率接近10%。對現(xiàn)有病毒性乙型肝炎患者及HBsAg攜帶者的防治工作，在今后幾十年里仍會是一項艱巨的任務。?

乙型肝炎病毒又是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，其基因組是由兩條螺旋的DNA鏈圍成的一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大小約為3.2KB，是一個相當小的病毒。其基因組共有四個開放閱讀框（open?reading?frame,?ORF），編碼以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L，M，S）。兩條螺旋的DNA鏈，其中一條較長負鏈已經(jīng)形成完整的環(huán)狀，另一條長度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。一旦感染肝細胞，病毒DNA就會入核，在核里，這條半環(huán)狀的DNA鏈要以負鏈為模板，在乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延伸，最終形成完整的環(huán)狀。乙肝病毒基因組也就形成了一個完整的環(huán)狀雙鏈DNA，即共價閉合環(huán)狀DNA（Covalently?closed?circular?DNA，cccDNA）。cccDNA可以看做是病毒復制的原始模板，既能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3.5KB的前基因組mRNA，又能轉(zhuǎn)錄出病毒mRNA并翻譯產(chǎn)生包括HBsAg在內(nèi)的四種病毒蛋白。病毒基因以其中的一條cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄形成前基因組mRNA之后，前基因組DNA逆轉(zhuǎn)錄形成負鏈DNA，復制出正鏈，最后再裝配到一起形成新的雙鏈乙型肝炎病毒DNA，其中一部分雙鏈DNA會在核里重新形成cccDNA。每個細胞核中大約15-20個拷貝的cccDNA可能會在易錯的病毒復制多聚酶的作用下發(fā)生病毒的變異，造成抗藥性。?

目前，治療乙型肝炎的藥物主要包括核苷酸類似物和干擾素等，其中以核苷酸類似物臨床應用最廣泛。核苷酸類似物可以阻斷病毒RNA和新的病毒DNA的產(chǎn)生，但是對于已經(jīng)存在的病毒cccDNA卻沒有作用。隨著HBV耐藥突變株的不斷出現(xiàn)，使得現(xiàn)有的抗HBV藥物難以達到理想的治療效果。此外，HBV?cccDNA還可能是病毒產(chǎn)生抗藥性的關(guān)鍵原因，因此，即使是部分失活HBV?cccDNA都具有重要的治療價值，這樣，特異性靶向HBV?cccDNA引起了人們的廣泛關(guān)注。?

2010年，Engineered?zinc?finger?nucleases?(ZFNs)?被成功的應用于HBV?cccDNA的敲除，效率大約為26%。2013年，Engineered?transcription?activator-like?effectors?(TALEs)?也被用于突變HBV?cccDNA，效率大約為35%，相應地，HBsAg降低了大約20%。很明顯，現(xiàn)有的技術(shù)還很難滿足需要，人們期待找到更高效的HBV?cccDNA的敲除策略。?