[發明專利]一種三色熒光標記篩選抗阿霉素腎毒性活性物質的方法

無效

• 申請號: 201410133330.8
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103969232A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 程翼宇;趙筱萍;王毅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于藥物篩選與評價方法領域，具體涉及一種三色熒光標記篩選抗阿霉素腎毒性活性物質的方法。

背景技術

慢性腎病是一種常見的復雜性疾病，在我國成人中的發病率為10.8%，已成為影響我國公眾健康的主要疾病之一。腎小管上皮細胞損傷是慢性腎病持續進展的重要因素，因此，篩選對腎小管上皮細胞具有保護作用的物質對慢性腎病治療藥物的發現具有重要意義。

腎小管上皮細胞損傷的引發原因是多樣的，藥物毒副作用是誘導因素之一。如阿霉素（Doxorubicin，DOX）是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物，被廣泛地應用于實體瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤治療。但阿霉素在使用過程中會產生較強的腎毒性，如何降低其毒副作用，一直是科研工作者的關注焦點。

近年來，基于熒光染色技術的檢測分析方法是應用于藥物高通量、高內涵篩選的重要方法之一。熒光顯微系統的應用解決了普通顯微鏡對細胞、細胞器的形態和活力方面相對微弱的改變難以觀察的問題，被應用于藥物研究的多個方面，如藥物細胞毒測定和藥物相互作用研究等。

如公開號為CN 101788480 B的中國專利文獻公開了一套熒光顯微系統，包含一個硬件系統好一個軟件系統，其中硬件系統由一臺熒光倒置顯微鏡及電腦構成，其中熒光導致顯微鏡包括熒光倒置顯微鏡主體，高精度可控電動平臺，平臺控制器，電荷耦合器，汞燈，汞燈控制器，手動操作桿，平臺控制器通過接線與熒光倒置顯微鏡主體相連，電荷耦合器通過接口與熒光倒置顯微鏡主體相連，其獲取的圖像信息由IEEE1394連接卡上傳至電腦儲存，汞燈控制器通過接線與熒光倒置顯微鏡主體相連，手動操作桿通過接線與熒光倒置顯微鏡主體相連；軟件系統包括：高精度可控平臺控制與圖像采集控制系統，圖像拼接系統，圖像識別系統。

熒光標記技術具有簡便、靈敏的特點，已經成為體外藥物篩選的重要技術之一。如公開號為CN 101982775 B的中國專利文獻公開了一種基于細胞熒光圖像的藥物篩選方法，通過控制熒光導致顯微鏡上的高精度可控電動平臺精確走位，應用熒光探針特異性標記細胞、細胞顯微圖像自動獲取、熒光圖像識別及數據生成，通過分析圖像信息來獲取心肌細胞保護作用的相關指標來篩選和評價活性組分。

該方法的不足之處在于，單色熒光標記用于藥物篩選研究時，獲得的信息單一，不利于全面評價化合物對細胞的作用，存在漏篩現象。

但目前還未見相關報道介紹以多種熒光染料同時標記腎臟細胞，通過細胞熒光成像判定腎細胞損傷程度和藥物保護效應的高內涵篩選方法。

發明內容

本發明公開了一種三色熒光標記篩選抗阿霉素腎毒性活性物質的方法，該方法利用三種熒光探針同時對腎細胞進行標記，一次性全方位地判定腎細胞損傷程度和藥物保護效應。

一種三色熒光標記篩選抗阿霉素腎毒性活性物質的方法，包括：

（1）取腎細胞，加入待篩選物質進行預保護；

（2）預保護完成后，加入阿霉素進行損傷；

（3）向損傷后的腎細胞中同時加入具有不同激發和發射波長的細胞膜完整性熒光探針、線粒體膜電位熒光探針與細胞核熒光探針，進行熒光標記。

（4）染色完成后采集、分析細胞熒光圖像，分別計算待篩選物質對腎細胞細胞膜、線粒體和細胞核的保護率；

（5）從待篩選物質中篩選出對腎細胞的細胞膜、線粒體和細胞核的保護率均大于15%的活性物質。

阿霉素引起腎毒性的損傷機制主要包括破壞細胞膜的完整性而引起的細胞活力下降，改變細胞線粒體膜電位和誘導細胞凋亡等。基于此，本發明選用了三種熒光探針，其中，胞膜完整性熒光探針用于反映細胞膜的完整性，線粒體膜電位熒光探針用于反映線粒體的損傷程度，細胞核熒光探針，用于反映細胞核雙鏈DNA的損傷程度。并且這三種熒光探針的激發和發射波長互不相同，便于分別獲取與熒光探針相對應的熒光圖像，互不干擾，單獨判斷待篩選物質對細胞膜、線粒體、細胞核的保護效果，并與陽性藥物進行對比，最終篩選出對腎細胞的細胞膜、線粒體和細胞核均具有較強保護效果的活性物質。

三種熒光探針同時染色不僅比分別染色節約了三分之二的工作量，減少了細胞和相關實驗耗材的用量，還消除了不同細胞樣品之間的差異引起的試驗誤差，檢測結果更為精確可信。同時，通過同時檢測藥物保護腎細胞后不同細胞器的損傷程度，可為活性物質對抗阿霉素腎毒性的作用機制提供有用線索，為后續的驗證實驗奠定更可靠的基礎。

本發明方法可在96孔板上進行，具體包括以下步驟：

（1）取腎細胞，加入待篩選物質進行預保護；