[發(fā)明專利]一種L-異亮氨酸羥化酶基因及其基因工程菌與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410132444.0
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103865940A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳寧;張成林;謝希賢;徐慶陽;劉淑云;劉遠;王鑫鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N1/21;C12N15/77;C12P13/04;C12R1/15
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種能特異性地催化L-異亮氨酸（L-Ile）生成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶基因及含有該基因的基因工程菌，利用該菌株生產(chǎn)（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸產(chǎn)物單一，具有較高的轉(zhuǎn)化率，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

4-羥基異亮氨酸（4-Hydroxyisoleucine，4-HIL）是一種主要存在于胡蘆巴屬植物種子中的L-異亮氨酸羥化物。研究表明4-羥基異亮氨酸具有葡萄糖濃度依賴的促進胰島素分泌的活性以及促進肌細胞對血糖吸收、加速脂肪代謝、降血脂和保護肝功能的作用。因此，作為有效預(yù)防和治療糖尿病及肥胖癥的理想藥物，4-羥基異亮氨酸具有廣泛的應(yīng)用前景和市場需求。

目前已報道的4-羥基異亮氨酸的生產(chǎn)方法包括提取法、化學(xué)合成法以及酶法，但僅提取法用于工業(yè)化生產(chǎn)。研究表明此方法獲得的4-羥基異亮氨酸構(gòu)型較多，但僅（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸具有上述生物學(xué)活性，從而使得該方法存在提取率低（僅為0.091-0.6%）、分離純化困難、原材料需求量大、成本高等不足。化學(xué)法合成4-羥基異亮氨酸的報道較多，但主要是以葡萄糖、薄荷酮或2-甲基乙酰乙酸乙酯為原料經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)生成，該方法反應(yīng)條件苛刻、步驟多、分離困難收率低，而且容易造成環(huán)境污染。酶法合成是以己醛、α-酮戊二酸化及L-谷氨酸為底物經(jīng)4-羥基-3-甲基-2-酮基-戊酸醛縮酶和分支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶兩步催化合成，該方法轉(zhuǎn)化率低且產(chǎn)品中含有大量α-氨基丁酸等副產(chǎn)物。

因此，采用特異性L-異亮氨酸羥化酶催化合成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸是較為理想的方法。盡管Haefelé等在胡蘆巴種子破碎液中發(fā)現(xiàn)能夠?qū)-異亮氨酸（L-Isoleucine,L-Ile）轉(zhuǎn)化為（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的活性組分，但至今未見后續(xù)研究報道。Kodera等（2009）首次報道了在蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis）中發(fā)現(xiàn)能特異性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶。然而目前公布的關(guān)于能特異性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶的基因序列有限，且未見采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的一個目的是提供一種能特異性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶基因（以ido表示），該基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示。其所編碼的L-異亮氨酸羥化酶的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO:2所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含所述L-異亮氨酸羥化酶基因的基因工程菌，利用基因克隆技術(shù)將所述L-異亮氨酸羥化酶基因連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化至宿主細胞進行表達，獲得能夠生產(chǎn)特異性催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的L-異亮氨酸羥化酶的基因工程菌。

本發(fā)明的另一個目的是針對目前（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的生產(chǎn)因提取（或反應(yīng)）液中不同構(gòu)型4-羥基異亮氨酸共存，但有生物活性的（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸濃度低，致使存在原材料需求量大、成本高、污染嚴重等問題，提供一種以L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為底物，采用微生物轉(zhuǎn)化法合成（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的生產(chǎn)方法，使得發(fā)酵液中僅存在（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸一種構(gòu)型的4-羥基異亮氨酸，并通過L-異亮氨酸羥化酶編碼基因過表達的方法進一步提高轉(zhuǎn)化效率，從而達到簡化工藝、降低生產(chǎn)成本。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一是：提供一種構(gòu)建上述基因工程菌的方法，包括如下步驟：

（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以本發(fā)明所述的L-異亮氨酸羥化酶編碼基因為模板、以IDO-3（SEQ?ID?NO:3）和IDO-4（SEQ?ID?NO:4）為引物，進行PCR擴增；

IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(Sal?Ⅰ)

IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoR?Ⅰ)

將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收后分別經(jīng)Sal?Ⅰ和EcoR?Ⅰ進行雙酶切，經(jīng)電泳、切膠回收后連接至表達載體pXMJ19，獲得重組質(zhì)粒。