[發明專利]一種L-異亮氨酸羥化酶基因及其基因工程菌與應用

有效

• 申請號: 201410132444.0
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103865940A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 陳寧;張成林;謝希賢;徐慶陽;劉淑云;劉遠;王鑫鑫
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N1/21;C12N15/77;C12P13/04;C12R1/15
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

1.一種編碼L-異亮氨酸羥化酶的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示。

2.權利要求1所述的基因編碼的L-異亮氨酸羥化酶，其氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO:2所示。

3.一種包含有權利要求1所述的基因的基因工程菌。

4.一種構建權利要求3所述基因工程菌的方法，步驟如下：

以權利要求1所述的L-異亮氨酸羥化酶編碼基因為模板、以IDO-3和IDO-4為引物，進行PCR擴增；

IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(Sal?Ⅰ)

IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoR?Ⅰ)

PCR條件為：94℃5min1個循環，94℃30s、56℃30s、72℃1min30個循環，72℃10min1個循環，反應體系為100μL，取10μL?PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；

將PCR擴增產物經回收后分別經SalⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，經電泳、切膠回收后連接至表達載體pXMJ19，獲得重組質粒，然后將其電轉化至谷氨酸棒桿菌ATCC13032細胞中，獲得重組菌株。

5.一種利用權利要求3所述菌株通過微生物轉化法生產（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的方法，包括以下步驟：

（1）種子培養：用接種環將1-2支經新鮮斜面活化的上述基因工程菌，接種至裝有100mL種子培養基的1L擋板搖瓶，于32-37℃，200rpm振蕩培養6-8h；

（2）菌體的發酵培養：以5%-10%接種量將步驟（1）的種子培養物接種至裝有3L發酵培養基的5L發酵罐進行發罐培養，發酵溫度32-37℃，溶氧維持在20-40%，流加濃度為60-80%W/V的葡萄糖溶液，流加25%W/V的氨水調節發酵液pH至6.8-7.2，發酵培養6-12h，按照10%接種量將一級種子液轉接入5L自動發酵罐，裝液量為3L，溶氧控制在20%-30%，培養溫度33℃，pH控制在7.0左右；

（3）向發酵罐中添加等物質的量濃度的L-異亮氨酸和α-酮戊二酸無菌溶液，使其終濃度為0.1-0.3mol/L，按步驟（2）繼續培養18-24h。

6.如權利要求5所述的一種通過微生物轉化法生產（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸的方法，其特征在于：

所述斜面培養成分為：葡萄糖1.0-5.0g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，NaCl2.0-3.0g/L，瓊脂25g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高壓蒸汽滅菌30min；

所述種子培養基成分為：葡萄糖25-30g/L，玉米漿15-30mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，KH₂PO₄0.5-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.1-0.5g/L，MnSO₄15-30mg/L，FeSO₄10-30mg/L，尿素2-5g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高壓蒸汽滅菌30min；

所述發酵培養基成分為：葡萄糖60-80g/L，K₂HPO₄3.0-5.0g/L，MgSO₄1.0-2.0g/L，MnSO₄20-50mg/L，FeSO₄20-50mg/L，玉米漿20-50mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，0.075MPa高壓蒸汽滅菌30min。