[發明專利]狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法

有效

• 申請號: 201410131925.X
• 申請日: 2014-04-03
• 公開（公告）號: CN103865888A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 郭采平;王春華;羅姍;劉永娣;容偉華;李慧;周維;周蘭貞;田華;張佩;丁玉江;黃偉榮;吳開永;張運佳;王紅冰;王錦才;吳恩應
• 申請（專利權）人: 深圳市衛光生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/205;A61P31/14
• 代理公司: 深圳市中知專利商標代理有限公司 44101
• 代理人: 孫皓;林虹

1.狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：將RV?CTN-1V5在vero細胞中連續傳10代，得到CTN-1V15株。

步驟二：將CTN-1V15株毒種在雞胚中傳1代，獲得的RV?CTN雞胚一代病毒。

步驟三：將RV?CTN雞胚一代病毒在雞胚成纖維細胞中進行傳代，使其逐漸適應雞胚成纖維細胞。

2.根據權利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，所述步驟一中，是用pH7.4的PBS將RV?CTN-1V5做10倍系列稀釋，然后按照1:100～1:1000的比例接種vero單層細胞，37℃吸附60分鐘后補加細胞維持液，置于37℃、5%CO₂培養箱內靜置培養，培養4～6天收獲病毒上清液，如此連續傳10代，得到CTN-1V15株。

3.根據權利要求2所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，所述步驟二中，是將CTN-1V15株毒種經pH7.4的PBS經1:10～1:1000稀釋后，取病毒稀釋液經卵黃囊接種6～7日齡的SPF雞胚，每胚0.5ml，置于37～39℃、相對濕度40～80%的全自動孵蛋箱內進行孵育，孵育至72～144小時，收取瀕臨死亡但未死亡的胚胎，去除雞胚的頭后，將軀干研磨粉碎，并按照雞胚重量加入病毒保護液制備成10%的病毒懸液，然后2000rpm、4℃離心10分鐘，如此傳一代獲得CTNCE01。

4.根據權利要求3所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，所述步驟三中，是將CTNCE01用pH7.4的PBS以10⁰～10^-4稀釋后，按照接種比例1:10～1:5×10⁵與CEC懸液混合均勻，分裝入細胞培養瓶內，置于35～37℃、5%CO₂培養箱內培養，培養至細胞出現病變收獲病毒液，繼續將病毒在CEC懸液上按照上述培養條件進行傳代，適應并穩定后得到CTNCEC25株。

5.根據權利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，步驟三中傳代中所使用的CEC懸液制備中采用的培養基為以199培養基為基礎，補充牛血清、HEPES和人血白蛋白，使牛血清的終含量為3～10%，HEPES終含量為20mmol/L，人血白蛋白的終含量為0.3～3%，并用7.5%的碳酸氫鈉溶液將pH調節至7.4～7.8。

6.根據權利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，步驟三中傳代所使用的溫度為33～36℃。

7.根據權利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，步驟三中傳代病毒接種的最佳MOI為0.001～0.05FFU/細胞，收獲病毒液的最佳時間為接種后72～96小時。

8.根據權利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細胞的適應方法，其特征在于，每一代毒種的病毒滴度均采用細胞熒光灶轉化單位實驗進行。

9.根據權利要求4得到的CTNCEC25株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。