[發(fā)明專利]梅嶺霉素合成基因簇中酮還原酶MeiF在手性芳香醇生產(chǎn)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410130983.0
• 申請(qǐng)日: 2014-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN104975048B
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭艦艇;季俊杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所
• 主分類號(hào): C12P7/22
• 分類號(hào): C12P7/22;C12N15/70;C12R1/19
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本發(fā)明公開了一種表達(dá)純化酮還原酶MeiF生物制備手性芳香醇的方法，及其在以芳香酮為底物生物制備手性芳香醇中的應(yīng)用。以純化的該酮還原酶和葡萄糖還原酶GDH作為催化劑，在只需要添加NADP+的條件下實(shí)現(xiàn)了以芳香酮為底物高效生物制備手性芳香醇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及南昌鏈霉菌(Streptomycesnanchangensis)中梅嶺霉素(Meilingmycin)合成基因簇中的酮還原酶MeiF及其編碼基因meiF，含有該基因的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的克隆菌株及表達(dá)菌株，及酮還原酶MeiF的表達(dá)及制備方法，還涉及酮還原酶MeiF作為催化劑在制備手性芳香醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

手性制藥業(yè)是目前醫(yī)藥行業(yè)的前沿領(lǐng)域，而手性藥物已在世界醫(yī)藥市場(chǎng)占有重要的份額，成為國(guó)內(nèi)外上新藥研究的熱點(diǎn)。對(duì)于手性藥物而言，其中的一個(gè)異構(gòu)體有效，另一個(gè)異構(gòu)體可能就無效甚至是有害。手性制藥具有很多優(yōu)勢(shì)：臨床上，對(duì)映體純的手性藥物既可以排除無效對(duì)映體所引起的毒副作用，也能減少藥劑量和人體對(duì)無效對(duì)映體的代謝負(fù)擔(dān)，提高藥物的專一性。因而具有十分廣闊的市場(chǎng)前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。手性藥物的前體一般是手性醇，像手性芳香醇類在藥物工業(yè)有重要的應(yīng)用，可分別作為合成(R)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等多種治療神經(jīng)系統(tǒng)、心血管等疾病的手性藥物的重要中間體。手性芳香醇一般可以利用從天然產(chǎn)物中提取、外消旋體拆分法、化學(xué)合成和生物合成等方法生成。相對(duì)于其他手性芳香醇的合成方法，生物酶催化的反應(yīng)條件溫和，無需強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、極端溫度和壓力；立體選擇性好，可避免因反應(yīng)條件苛刻而導(dǎo)致的消旋化、異構(gòu)化及重排等副反應(yīng)，也免除了傳統(tǒng)有機(jī)合成中通常為了阻斷不必要的副反應(yīng)而需要的基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)措施；反應(yīng)效率高，能大幅度加快反應(yīng)速度。同時(shí)酶催化反應(yīng)一般不會(huì)產(chǎn)生毒副產(chǎn)物，在環(huán)境污染問題上比傳統(tǒng)化學(xué)合成方法要小得多，具有廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是重組大腸桿菌表達(dá)酮還原酶MeiF制備手性芳香醇的方法。

為解決上述技術(shù)問題，設(shè)計(jì)技術(shù)方案如下：

用于不對(duì)稱制備手性芳香醇的重組大腸桿菌，是導(dǎo)入酮還原酶基因meiF的大腸桿菌。用于提供還原力NADPH的大腸桿菌為導(dǎo)入了葡萄糖脫氫酶GDH的大腸桿菌。

上述酮還原酶基因meiF含有813bp堿基，在Genebank中的收錄號(hào)是FJ952082.1，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。有該基因編碼的酮還原酶MeiF包含270個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述葡萄糖脫氫酶GDH基因含有786bp堿基，其在Genebank中的收錄號(hào)為D50453.1，其基因序列如SEQ ID NO：3所示。由該基因編碼的葡萄糖脫氫酶包含261個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本發(fā)明從南昌鏈霉菌(Streptomyces nanchangensis)基因組中克隆了酮還原酶MeiF編碼基因，將其構(gòu)建到表達(dá)載體pET28a上并在大腸桿菌中表達(dá)。從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因組中克隆了葡萄糖還原酶GDH的編碼基因，并將其構(gòu)建到表達(dá)載體pET28a上并在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)所用的大腸桿菌是本實(shí)驗(yàn)室保藏的Ecoli BL21(DE3)。

構(gòu)建上述重組大腸桿菌的方法如下：PCR克隆酮還原酶MeiF編碼基因和葡萄糖還原酶GDH的編碼基因，將其構(gòu)建到pET28a上分別在大腸桿菌中表達(dá)，獲得制備手性芳香醇的重組大腸桿菌。

構(gòu)建的表達(dá)酮還原酶的大腸桿菌能以芳香酮為底物合成手性芳香醇，而所構(gòu)建的葡萄糖脫氫酶GDH能以葡萄糖為輔助底物，使得NADPH循環(huán)再生，所以在反應(yīng)中加入少量的NADP+就可以實(shí)現(xiàn)NADPH的高效循環(huán)利用。

酮還原酶MeiF及葡萄糖還原酶GDH的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件如下：表達(dá)溫度16度，搖床轉(zhuǎn)速220rpm，IPTG濃度為0.3mM，表達(dá)時(shí)間為12-16小時(shí)。