[發(fā)明專(zhuān)利]微球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410130428.8
• 申請(qǐng)日: 2014-04-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966241A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱晨光;王菁;張貴敏;凌慧玲;唐遠(yuǎn)平;梅冰;宋任濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/52
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/52;C12N9/00;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 上海上大專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。特別是一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。

背景技術(shù)

氮元素是生物體需求量最大的礦物質(zhì)元素，用于合成生物體所需的氨基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮的利用在農(nóng)作物生產(chǎn)中占非常重要的地位，植物氮代謝及其調(diào)控一直備受全世界關(guān)注。然而，目前氮肥利用率低且過(guò)量施用造成水環(huán)境污染的問(wèn)題已成為世界性難題。因此，如今需要降低氮肥的使用量，并尋找氮利用率更高的植物品系，以保證在產(chǎn)量不下降的前提下，減少氮肥的使用量。

生物體對(duì)氮素的同化是十分重要的生理過(guò)程，無(wú)機(jī)氮必須同化為谷氨酰胺形式的有機(jī)氮才能被生物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase ,GS）是氮同化路徑的關(guān)鍵酶，它和谷氨酸合成酶聯(lián)合作用，催化NH₄⁺同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，將其酰胺轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸上，從而生成兩分子的谷氨酸。谷氨酰胺在生物體內(nèi)含氮有機(jī)物的生物合成中作為氮供體，而外界的無(wú)機(jī)氮元素也通過(guò)這個(gè)途徑進(jìn)入生物體內(nèi)的整個(gè)氮素循環(huán)。因此GS在生物體氮同化過(guò)程中起到了十分重要的作用。

通過(guò)異源基因的導(dǎo)入和重組, 有可能獲得高水平表達(dá)GS的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株對(duì)氮的利用率將大大提高, 在氮貧瘩的土壤中能正常或超常生長(zhǎng), 這無(wú)論在理論和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上均具有重要意義。細(xì)菌的谷氨酰胺合成酶涵蓋了目前所發(fā)現(xiàn)的三大類(lèi)谷氨酰胺合成酶GSI、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有種類(lèi)多和容易克隆的優(yōu)越性。微球菌（Micrococcus sp.）是一類(lèi)常見(jiàn)的土壤細(xì)菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鑒定對(duì)于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株并應(yīng)用于改善逆境下農(nóng)作物的生理性狀有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供了一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因。

本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。

本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)：

一種微球菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID NO.1所示的堿基序列。

一種上述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。

一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組載體。

一種克隆上述的微球菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的微球菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設(shè)計(jì)了引物，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴(kuò)增得到谷氨酰胺合成酶基因；所述的引物為：Micoc1F: 5’-ATGTTCACCTCCCCCGCGGA-3’和Micoc1R: 5’-TCAGACCGAGTAGTAGAGCT–3’。

上述的PCR擴(kuò)增的條件為：94℃ 5分鐘；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 1分30秒，25個(gè)循環(huán)；72℃ 8分鐘。

本發(fā)明的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了谷氨酰胺合成酶基因Mico3所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，能恢復(fù)大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時(shí)也預(yù)示了它在其他生物氮高效利用方面的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1和2為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)圖，表明該編碼蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性很大；

圖3為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白的進(jìn)化分析圖，表明該編碼蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族；

圖4為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017(Genotype: F-,[araD139]B/r,Δ(argF-lac)169,flhD5301,Δ(fruK-yeiR)725(fruA25),relA1,rpsL150(strR),Δ(glnG-glnA)229,ha-10,deoC1）中的功能互補(bǔ)分析圖。培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，轉(zhuǎn)入Mico3和未轉(zhuǎn)入Mico3的菌株均可以正常生長(zhǎng)；