[發明專利]一種含海藻糖的牛卵母細胞體外成熟培養液及培養方法

有效

• 申請號: 201410130174.X
• 申請日: 2014-04-02
• 公開（公告）號: CN103881967A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 王爭光;李正操;俞頌東
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12N5/073
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃芳

（一）技術領域

本發明涉及一種含海藻糖的牛卵母細胞體外成熟培養液，以及利用所述牛卵母細胞體外成熟培養液進行牛卵母細胞體外成熟培養及體外受精的方法。

（二）背景技術

隨著現代繁殖生物技術的發展及胚胎體外生產技術的逐步完善，利用體外受精、體細胞核移植等技術生產體外胚胎已呈現出廣闊的應用前景。家畜胚胎體外生產尤其是體細胞核移植是快速擴大優秀種群數量的有效途徑。獲得足夠數量的成熟卵母細胞是胚胎體外生產的前提條件。雖然，從活體動物采集卵母細胞已經在生產中得到了初步應用，但是這種方法具有操作復雜、對母畜傷害大、需要精密儀器及獲取卵母細胞數目少等不足。對于大規模的通過體外受精或是體細胞核移植生產體外胚胎，從屠宰場采集的卵巢中抽取卵母細胞并進行體外培養是獲取成熟卵母細胞最有效、最經濟的途徑。

目前的研究表明，體外成熟的卵母細胞進行體外受精后，其受精、卵裂及早期胚胎發育率較低，囊胚發育率低于50%，核移植胚胎的發育率更低，限制了胚胎體外生產技術在實踐中的推廣應用。導致體外胚胎發育率低的一個主要原因是卵母細胞體外成熟及培養系統的缺陷造成胞質未完全成熟所致。卵母細胞成熟包括核成熟和胞質成熟，只有二者均成熟才具有受精能力和發育潛力。核成熟的標志是第一極體的排放，而胞質成熟的判斷標準尚未統一。卵母細胞受精后的前三個細胞周期的一切事件是由成熟過程中貯存在細胞質中的rRNA、mRNA和蛋白質負責完成，因此胞質成熟對卵母細胞受精后發育潛力的影響顯得尤為重要。同樣對用于核移植的受體卵母細胞，胞質的成熟質量將直接影響重構胚能否維持正常的分裂及后期發育。因此，改進卵母細胞體外成熟培養條件對提高體外胚胎生產效率意義重大。

海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖，化學性質穩定，對熱、酸都不敏感，與蛋白質和氨基酸混合加熱時也不會發生著色變化。并具有獨特的生物學特性、對生物抗脫水的保護作用、抗冷凍保護作用和抗高滲保護作用，在各種惡劣環境下，海藻糖表現出對物種的生物膜、蛋白質和核酸等生物大分子良好的保護作用。對于海藻糖的研究已有文獻報道。CN103450288A、CN103146779A、CN102965412A、CN102337313A、CN101831474A、CN1807465A等多種專利申請公開了海藻糖的合成或純化方法。CN101181279A、CN1302812C、CN100571707C、CN101443344A等多種專利公開了海藻糖在醫藥領域的用途。而CN101513221A、CN103250880A等多種專利公開了海藻糖用作動物飼料添加劑的用途。但到目前為止，尚未見有關海藻糖用于家畜繁殖技術領域，特別是用于卵母細胞體外成熟培養的報道。

（三）發明內容

本發明的目的是提供一種含海藻糖的牛卵母細胞體外成熟培養液及培養方法，本申請發明人就海藻糖用于卵母細胞體外成熟培養進行了長時間的研究，從而完成了本發明，該培養液具有促進體外培養卵母細胞的胞質成熟，提高卵母細胞體外受精后胚胎發育率的功能。

本發明采用的技術方案是：

一種含海藻糖的牛卵母細胞體外成熟培養液，所述牛卵母細胞體外成熟培養液組成如下：海藻糖0.1～1.0mg/mL，大豆甙元0.1～10μg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL，血清體積百分含量8%～20%，溶劑為常規培養液；所述常規培養液為M199、DMEM、F12、MEM中的一種或多種。

所述海藻糖已有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術，并已有商品出售，較為成熟的生產和銷售廠家有河南華諾海藻生物工程有限公司、武漢富瑞斯凱材料供應有限公司、廈門美拉德食品配料有限公司、Sigma公司等。本發明中所用海藻糖購自Sigma公司，純度大于98%。

所述大豆甙元已有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術，并已有商品出售，較為成熟的生產和銷售廠家有西安融升生物科技有限公司、成都新基科技有限公司、Sigma公司等，本發明中所用大豆甙元購自Sigma公司。由于大豆甙元不溶于水，因此通常先用少量有機溶劑如DMSO溶解之后再進行培養基的配制。

優選的，所述培養液組成如下：

溶劑為M199培養液。

本發明還涉及一種利用所述牛卵母細胞體外成熟培養液進行牛卵母細胞體外培養及體外受精的方法，所述方法包括：