[發(fā)明專利]試劑盒及確定待測(cè)DNA樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基因型的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410129862.4
• 申請(qǐng)日: 2014-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104975070A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐謀勝;曹旸;袁亞燕;王珊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北維達(dá)健基因技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及試劑盒及確定待測(cè)DNA樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基因型的方法。?

背景技術(shù)

華發(fā)林（Warfarin，也稱為“華法林”）是臨床上最常用的香豆素類口服型強(qiáng)抗凝藥物，廣泛用于心臟瓣膜置換、房顫、肺栓塞、再次腦卒中（中風(fēng)）等深度動(dòng)靜脈血栓性疾病的預(yù)防和治療。該藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-(a-苯基丙酮)-4-羥基香豆素，為兩種光學(xué)同分異構(gòu)體R型和S型的消旋體(racemic)混合物，其中S異構(gòu)體的抗凝作用比R異構(gòu)體更強(qiáng)3～5倍。華法林使用劑量在不同種族間及個(gè)體間存在較大差異，甚至可相差10到20倍。影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華法林國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)盟在新英格蘭發(fā)表的研究顯示，加入藥物基因組學(xué)的預(yù)測(cè)模型（包括基因型）比臨床預(yù)測(cè)模型（不包括基因型）準(zhǔn)確性提高了80%。所以個(gè)體的遺傳特征對(duì)于華法林的劑量影響很大。?

目前研究發(fā)現(xiàn)與華法林藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30多種，起主要作用的有2種，VKORC1為其中之一。美國(guó)FDA在華法林用藥說(shuō)明書(shū)里介紹了VKORC1基因?qū)┝康挠绊懖⒔ㄗh在用藥之前做基因檢測(cè)。VKORC1基因編碼的蛋白質(zhì)為組成維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位之一，主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點(diǎn)。VKORC1基因啟動(dòng)子區(qū)-1639G＞A多態(tài)性位點(diǎn)(rs9923231)與華法林臨床用藥劑量相關(guān)。與AA基因型啟動(dòng)子相比，GG和AG基因型啟動(dòng)子活性高，凝血因子生成較多，患者臨床表現(xiàn)出華法林抵抗。在亞洲人群中研究結(jié)果顯示，VKORC1的基因多態(tài)對(duì)華法林劑量差異的影響達(dá)到了16-30%。因而，華法林用藥之前，需藥個(gè)體的VKORC1基因的rs9923231位點(diǎn)的基因型檢測(cè)和分型，意義重大。?

然而，現(xiàn)階段VKORC1基因的rs9923231位點(diǎn)的檢測(cè)和基因型分型的方法仍有待改進(jìn)。?

發(fā)明內(nèi)容

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：?

目前檢測(cè)SNP位點(diǎn)的最簡(jiǎn)單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過(guò)應(yīng)用特異性限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)消化位點(diǎn)是否消失來(lái)判斷其變異存在與否。但該方法操作復(fù)雜，樣本量多時(shí)易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過(guò)度而出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，可靠性低。多重PCR方法盡管特異性有所提高，但是仍然是基于普通PCR的原理，引物特異性以及低保真Taq酶等這些因素均可造成對(duì)結(jié)果的影響。DNA?測(cè)序法雖然是目前進(jìn)行基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但步驟繁瑣，過(guò)程復(fù)雜，試劑價(jià)格昂貴，容易出現(xiàn)樣本間的交叉污染而導(dǎo)致測(cè)序失敗；另外測(cè)序儀的裝備也超出了一般臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的承受范圍。高分辨率熔解曲線法是一種快速，簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，實(shí)用的分型方法，但基因分型依賴于儀器溫度控制的精密性，假陽(yáng)性高。Taqman探針雜交法采用特異性的熒光標(biāo)記的探針，特異性強(qiáng)，靈敏度高且操作方便，快速。該方法同樣被認(rèn)為是SNP分型的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床應(yīng)用的前景值得期待。Taqman探針雜交法的原理為：在TaqMan探針?lè)ǖ腜CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針，探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基因，如FAM、VIC，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，如MGB?TAMRA；當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基因所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)；隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3’-5’外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。由此，應(yīng)用一對(duì)雙熒光標(biāo)記的Taqman探針，分別針對(duì)雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才能夠擴(kuò)增出各自的基因型；用兩種熒光信號(hào)能夠被顯著區(qū)分的熒光染料分別標(biāo)記這兩種探針，就可以在一次PCR反應(yīng)中完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定。因而，利用該方法進(jìn)行SNP基因型分型時(shí)，引物和探針的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，引物長(zhǎng)度、探針長(zhǎng)度、引物特異性和探針特異性均會(huì)顯著影響檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性。?

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效用于VKORC1基因的rs9923231位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，以及確定待測(cè)DNA樣本的VKORC1基因的rs9923231位點(diǎn)的基因型的方法。?