[發明專利]一種海馬活性糖蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201410129587.6
• 申請日: 2014-04-01
• 公開（公告）號: CN103923201A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 徐永健;宿宇婷;姜展志
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/14;C07K1/34
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及一種糖蛋白的制備方法，尤其是涉及一種海馬活性糖蛋白的制備方法。?

背景技術

海馬為海龍科動物，性溫、味甘、歸肝、腎經，屬于藥食同源類生物，是名貴的海洋滋補藥物，在我國素有“北方人參，南方海馬”之稱，具有極高的經濟價值。2005《中國藥典》收載原動物主要有五種：線紋海馬Hippocampus?kelloggi?Jordan?et?Snyder、刺海馬H.?histrix?Kaup、大海馬H.?kuda?Bleeker?、三斑海馬H.?trimaculatus?Leach或小海馬（海蛆）H.?japonicus?Kaup的干燥體。夏、秋二季捕撈，洗凈，曬干；或除去皮膜及內臟，曬干。?

海馬藥用歷史悠久，歷代古醫籍及我國藥典歷次版本一部（中藥部分）均有收載。公元739年，《本草拾遺》古醫籍中陳藏器首次使用海馬之名；《神農本草》古醫籍中記載：海馬性溫、味甘、無毒，具有強身補腎、舒筋活絡、止痛止血、退熱生肌、強心明目、祛疾止喘、夫人催生等功能；明代《本草綱目》記載：海馬雌雄成對，其性溫暖，有交感之意，故難產及陽虛房中方術多用之，具有暖水臟、壯陽道之功能。現代醫學已經證明海馬具有較高的營養價值和化學活性成分，含有大量的鎂、鈣，其次為鋅、鐵、鍶、錳，少量的鈷、鎳、銅和鉻，還含有大量的硬脂酸、膽甾醇、膽甾二醇，其不飽和脂肪酸占總脂肪酸比例較高，其中多烯不飽和脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）較為豐富。海馬具有補腎壯陽、調氣活血等功效，臨床上主要用于治療陽痿、遺尿、虛喘、癥積等。目前對海馬化學成分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、磷脂、脂肪酸和甾體類等，對水溶性組分的研究較少，所以海馬水溶性組分的研究有利于人們對海馬的認識更加完整。?

海洋擁有特殊的生態環境，賦予了海洋生物異于陸生生物所特有的化學成分和結構，具有特異的高活性、高藥效。近年來對海洋藥物的研究越發深入，越來越多的研究發現糖蛋白具有很好的醫療保健功效，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、提高免疫力等活性。糖蛋白涉及細胞的定向歸巢、糖蛋白毒素及激素作用機制，可使藥物選擇性地集中到病灶，提高藥效，而不影響正常組織的生長和免疫系統的功能，降低不良反應。海馬蛋白質含量豐富，高達70%左右。現代科學已證明80%以上的蛋白質都是糖蛋白，包括許多酶、激素、毒素、載體蛋白、免疫球蛋白、結構蛋白、凝集素、受體、粘液組分等，甚至過去人們一直認為是“純”的多糖，如糖原和纖維素，亦含有少量共價結合的蛋白質。目前，國內外對海馬糖蛋白的制備的研究還未見相關報道。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種具有高效、快速并能保持糖蛋白活性的海馬糖蛋白制備方法。?

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種海馬活性糖蛋白的制備方法，包括以下步驟：?

（1）海馬前處理：將海馬洗凈凍好后，于-40℃下冷凍干燥48-72h，再用粉碎機粉碎，然后采用CO₂超臨界流體萃取技術脫除脂肪酸，得到脫脂海馬粉；

（2）海馬糖蛋白提取：將步驟（1）得到的脫脂海馬粉與NaCl濃度為0～0.25mol/L的浸提液按（10～35）g：1mL的比例混合于錐形瓶中搖勻后，首先進行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于30℃～80℃下浸提1～6h后，用濾紙過濾，得到的上清液即為海馬糖蛋白混合溶液；

（3）海馬糖蛋白粗純化：將步驟（2）得到的海馬糖蛋白溶液減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，將糖蛋白樣品液采用Sevage法除游離蛋白，脫蛋白一次，4℃靜置過夜，棄下層游離蛋白層；收集上層糖蛋白溶液，進行乙醇分級沉淀，然后將沉淀收集，將沉淀用丙酮、乙醚各洗滌2次，然后用蒸餾水復溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，得到海馬糖蛋白粗純品。

?步驟（1）中所述的CO₂超臨界流體萃取技術進行脫脂的條件為：載氣為高純度CO₂，萃取壓強35MPa、萃取時間135min、萃取溫度58℃、分離釜溫度80℃、CO₂流量15L/h，其中萃取時間依次由動態萃取10min和靜態萃取125min組成。?

步驟（2）中所述的超聲波輔助提取的條件為：超聲功率500W，超聲時間20min。?