[發明專利]一種海馬活性糖蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201410129587.6
• 申請日: 2014-04-01
• 公開（公告）號: CN103923201A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 徐永健;宿宇婷;姜展志
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/14;C07K1/34
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）海馬前處理：將海馬洗凈凍好后，于-40℃下冷凍干燥48-72h，再用粉碎機粉碎，然后采用CO₂超臨界流體萃取技術脫除脂肪酸，得到脫脂海馬粉；

（2）海馬糖蛋白提取：將步驟（1）得到的脫脂海馬粉與NaCl濃度為0～0.25mol/L的浸提液按（10～35）g：1mL的比例混合于錐形瓶中搖勻后，首先進行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于30℃～80℃下浸提1～6h后，用濾紙過濾，得到的上清液即為海馬糖蛋白混合溶液；

（3）海馬糖蛋白粗純化：將步驟（2）得到的海馬糖蛋白溶液減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，將糖蛋白樣品液采用Sevage法除游離蛋白，脫蛋白一次，4℃靜置過夜，棄下層游離蛋白層；收集上層糖蛋白溶液，進行乙醇分級沉淀，然后將沉淀收集，將沉淀用丙酮、乙醚各洗滌2次，然后用蒸餾水復溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，得到海馬糖蛋白粗純品。

2.根據權利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的CO₂超臨界流體萃取技術進行脫脂的條件為：載氣為高純度CO₂，萃取壓強35MPa、萃取時間135min、萃取溫度58℃、分離釜溫度80℃、CO₂流量15L/h，其中萃取時間依次由動態萃取10min和靜態萃取125min組成。

3.根據權利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于：步驟（2）中所述的超聲波輔助提取的條件為：超聲功率500W，超聲時間20min。

4.根據權利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于：步驟（2）中所述的浸提液中NaCl濃度為0.08mol/L，所述的浸提溫度為72.77℃，所述的浸提時間為4.27h，所述的脫脂海馬粉與所述的NaCl浸提液的料液比21.41?g：1mL。

5.根據權利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟（3）中所述的Sevage法除游離蛋白的條件為：糖蛋白樣品液與Sevage試劑比例為4:1，所述的Sevage試劑由氯仿與正丁醇按5:1的比例混合而成。

6.根據權利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟（3）中所述的乙醇分級沉淀條件為：將收集的糖蛋白溶液層依次加入無水乙醇，分別在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時于4℃沉淀12h，最后收集各乙醇濃度下得到的沉淀。

7.根據權利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟（3）得到的海馬糖蛋白粗純品進行精純化的過程為：取海馬糖蛋白粗純品按質量體積比0.2g：5mL的比例溶解在去離子水中，過0.45μm濾膜后取樣品液，將樣品液上DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離純化，上樣后分別用0.05、0.1、0.5mol/L?NaHCO3進行階段性洗脫，每個濃度洗脫120min，在280nm處采用紫外吸收法檢測糖蛋白的出峰位置，分別收集含有糖蛋白組分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷凍干燥，得到不同分子量的海馬糖蛋白精純品。