[發(fā)明專利]基于內切葡聚糖酶的工程菌及其實現(xiàn)方法無效

申請?zhí)枺?/td>	201410126921.2	申請日：	2014-03-31
公開（公告）號：	CN103881957A	公開（公告）日：	2014-06-25
發(fā)明（設計）人：	周培;馮海瑋;支月娥;初少華;孫玉靜;羅艷青	申請（專利權）人：	上海交通大學
主分類號：	C12N1/21	分類號：	C12N1/21;C12N15/70;C12N15/56;C12N9/42;C12R1/19;C12R1/465
代理公司：	上海交達專利事務所 31201	代理人：	王毓理;王錫麟
地址：	200240 ***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	基于內切葡聚糖工程及其實現(xiàn) 方法
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【說明書】：

技術領域

本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程技術領域的基因及其實現(xiàn)方法，具體是一種能夠外源表達內切葡聚糖酶(Sg-Ega)的大腸桿菌工程菌及其實現(xiàn)方法。?

背景技術

木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生的主要干物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。據(jù)估計，每年全世界綠色植物光合作用產生的木質纖維素總干重為l730億t，所含總能量可達2×1018kJ，相當于每年全世界消耗能量的10倍。木質纖維素的生物降解和解聚作用是一個高度復雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。?

木質纖維素中的纖維素組分是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機溶劑，性質穩(wěn)定；纖維素降解需要纖維素酶的參與，纖維素酶并不是一種簡單的酶，而是由若干種相互關聯(lián)的酶組成的一個復雜的酶系統(tǒng)，主要由3類組成：內切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-β-1,4-glucanase)，又被稱為Cx酶；外切葡聚糖酶(Exoglucanses)，又被稱為C1酶；內切葡聚糖酶(β-glucosidase)，又被稱為BG酶或CB酶。目前普遍接受的觀點是3種酶協(xié)同作用于纖維素的降解過程，即首先由Cx酶在纖維素聚合物的內部起作用，在纖維素的非結晶部位進行切割，產生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位，從末端進行水解，最后由CB酶將纖維二糖徹底水解為葡萄糖。因此，內切葡聚糖酶在纖維素的酶降解過程中起十分關鍵的作用。?

目前，各種纖維素酶基因均已在細菌中發(fā)現(xiàn)并被克隆。與真核生物纖維素酶基因相比，細菌纖維素酶基因具有不含內含子、易克隆、易表達及種類多等優(yōu)勢。其中，灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)是一種常見的土壤細菌(或放線菌)。作為一種放線菌，灰略紅鏈霉菌之前的研究重點為如何改造其代謝途徑以提高抗生素尤其是鏈霉素的發(fā)酵產量，對其基因組內其他功能基因的開發(fā)和利用還相對較少。?

與大多數(shù)細菌相比，鏈霉菌具有較為復雜的生長、分化機制，對大分子多糖物質有很強的分解利用能力，如纖維素等。因此，研究鏈霉菌對大分子多糖物質的分解利用機制，發(fā)現(xiàn)全新的纖維素酶基因序列并通過克隆和轉基因的方式對目的基因進行外源表達，對新型纖維素酶制劑的開發(fā)及生產具有重大意義。?

發(fā)明內容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提出一種基于內切葡聚糖酶的工程菌及其實現(xiàn)方?法。?

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：?

本發(fā)明涉及一種基于內切葡聚糖酶的工程菌，能夠外源表達內切葡聚糖酶的DH5α大腸桿菌。?

所述工程菌通過以下方式構建得到：?

1)設計并合成PCR引物，自灰略紅鏈霉菌JSD-1（CGMCC?NO.5706）基因組DNA為模板進行PCR擴增；?

所述的PCR引物是指含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點的引物，具體包括：?

正向引物Ega-NdeⅠ-F:?

5'-GGAATTCCATATGACCAACGGCTTCTACGTGGACCCCG-3'?

反向引物Ega-EcoRⅠ-R:?

5'-GGAATTCTCAGTAGCCGTAGATCATCTTGTAGGCGACCTC-3'?

所述的PCR擴增采用PrimeSTAR?GXL高保真酶(TaKaRa)進行擴增，PCR擴增條件為：98℃預變性3min；98℃變形10s，68℃延伸1min；30個循環(huán)后68℃終延伸3min。?