[發明專利]基于內切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法

無效

• 申請號: 201410126921.2
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN103881957A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;支月娥;初少華;孫玉靜;羅艷青
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/56;C12N9/42;C12R1/19;C12R1/465
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種基于內切葡聚糖酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達內切葡聚糖酶的DH5α大腸桿菌；

所述的內切葡聚糖酶具體為β-1,4-內切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

所述的β-1,4-內切葡聚糖酶具有Sg-Ega基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其長度為870個堿基對，編碼289個氨基酸，分子量為30.6KD。

2.根據權利要求1所述的工程菌的實現方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)設計并合成PCR引物，自灰略紅鏈霉菌JSD-1（CGMCC?NO.5706）基因組DNA為模板進行PCR擴增；

所述的PCR引物是指含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點的引物，具體包括：

正向引物Ega-NdeⅠ-F:

5'-GGAATTCCATATGACCAACGGCTTCTACGTGGACCCCG-3'

反向引物Ega-EcoRⅠ-R:

5'-GGAATTCTCAGTAGCCGTAGATCATCTTGTAGGCGACCTC-3'

2）構建具有Sg-Ega基因的質粒：將步驟1得到的PCR擴增產物切膠回收后連接至克隆載體，并導入DH5α大腸桿菌感受態細胞；挑取具有相應抗性的克隆并通過菌落PCR進行鑒定，直至獲得陽性克隆后挑取并搖菌提取得到pET-30a質粒。

3）構建具有Sg-Ega基因的表達載體；

4）將表達載體轉化至大腸桿菌：將步驟3中得到的含有Sg-Ega基因的表達載體質粒轉入Transetta感受態細胞內。通過具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB液體培養基進行篩選獲得陽性克隆，即含有Sg-Ega基因的工程菌。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增采用PrimeSTAR?GXL高保真酶進行擴增，PCR擴增條件為：98℃預變性3min；98℃變形10s，68℃延伸1min；30個循環后68℃終延伸3min。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的步驟3具體包括：

3.1)用NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切處理含有Sg-Ega基因的克隆質粒后通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有Sg-Ega基因的片段；

3.2)用NdeⅠ和EcoRⅠ內切酶處理pET-30a質粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收載體片段；

3.3)將兩次回收的DNA片段混合，在T4DNA?Ligase的作用下過夜連接，然后導入DH5α大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆并擴大培養提取其質粒，獲得含有Sg-Ega基因的表達載體。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的克隆載體采用pEASY-Blunt?Simple?Cloning?Vector。