[發明專利]CRY報告基因載體的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201410126537.2
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN103937825A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 張傳茂;張博言
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/79;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及CRY報告基因載體的構建方法及其應用。

背景技術

物質在細胞內的運輸存在自由擴散與主動運輸兩種方式，后者顯然對生物分子在特定位置發揮特定的作用具有決定性意義。在細胞向外分泌物質、細胞膜受體由高爾基體向細胞膜表面靶向運輸及內質網與高爾基體之間進行物質交換的過程中，膜泡運輸具有重要地位。Rab蛋白是一類包含數十種成員的GTP酶家族，其主要功能在于接力式地引導處于運輸不同階段中的膜泡，從而實現膜泡的定向運輸。Rab8蛋白主要調控膜泡向靶膜的錨定與融合過程，在膜泡由高爾基體向中心體的定向運輸中具有重要作用。Rab8蛋白的活性由其所結合的GTP/GDP狀態決定，因此參與到調控GTP/GDP分子在Rab8結合位點進行交換的一系列蛋白均參與Rab8活性的調控。這些蛋白中，TBC1D1/4/30特異性水解GTP，而Rabin8和GDI2則分別催化GTP的裝載及抑制GDP的解離。

現有研究表明，Rab8蛋白對于纖毛的正常組裝具有重要調控作用：其不能水解GTP的突變體Rab8^Q67L促進纖毛組裝，而其處于GDP結合狀態的模擬突變體Rab8^T22N抑制纖毛組裝。纖毛這一細胞器在個體發育過程中左右對稱的形成、細胞對外界信號的感知以及細胞周期調控方面均具有重要作用。因此，對Rab8功能的研究，將有助于闡明纖毛組裝與去組裝的分子機制及膜泡介導的信號通路調控，從而為纖毛病的治療提供理論依據。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供CRY報告基因載體的構建方法及其應用。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種CRY報告基因載體的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

（1）將Rabin8蛋白中與Rab8特異性結合的氨基酸序列RBD（101～300殘基，Rab8Binding?Domain，RBD）連入真核表達載體pECFP，構成CFP-RBD序列（CR）；

（2）將上述CFP-RBD序列進行克隆，再連入真核表達載體pEYFP，構成CFP-RBD-YFP序列（CRY），得到報告基因載體CRY；

所述Rabin8蛋白中與Rab8特異性結合的氨基酸序列RBD如SEQ?ID?No.1所示。

將上述報告基因載體轉染目標細胞（組裝或不組裝纖毛的細胞均可），通過載體上的抗性基因，可以進行穩定表達系的篩選。

可選的，上述報告基因載體的構建方法可先構建RY再構建CRY，或構建YFP-RBD-CFP（YRC）。

進一步地，所述真核表達載體pECFP為pECFP-C1/2/3或pECFP-N1/2/3。

進一步地，所述真核表達載體pEYFP為pEYFP-C1/2/3或pEYFP-N1/2/3。

本發明還提供了按照上述構建方法構建得到的報告基因載體CRY。

進一步地，所述報告基因載體CRY的報告基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明還提供了前述報告基因載體在檢測細胞內Rab8^GDP中的應用，其利用報告基因載體CRY的報告基因所編碼的蛋白定位及識別Rab8^GDP，并對細胞內游離狀態的Rab8^GDP進行半定量分析和定位分析，從而特異性追蹤細胞內Rab8^GDP的變化。

本發明的有益效果在于：

本發明提供一種便利的、能夠檢測細胞內Rab8^GDP動態變化的方法。實驗證明，本發明的CRY報告基因所編碼的蛋白在定位及識別Rab8^GDP方面與內源Rabin8蛋白無異，且能夠對細胞內游離狀態的Rab8^GDP進行半定量分析和定位分析，從而可用于特異性追蹤細胞內Rab8^GDP的變化及功能研究。

附圖說明

圖1為CRY報告基因的構建流程圖。

圖2為CRY報告基因的工作原理，及其所編碼的蛋白與內源Rabin8蛋白功能和定位的比較。

圖3為CRY報告基因所編碼蛋白對Rab8^GDP含量的應達。

圖4為CRY所示干涉某基因對細胞內游離狀態Rab8^GDP含量的

影響。

具體實施方式