[發明專利]一種用于預防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應用

有效

• 申請號: 201410125958.3
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN103865890B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 熊思東;董春升;徐薇;吳飛
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/86;A61K48/00;A61K39/125;A61P31/14;A61P9/00;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州廣正知識產權代理有限公司32234
• 代理人: 張利強

技術領域：

本發明涉及生物基因技術，尤其涉及一種重組病毒，特別是一種用于預防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應用。

背景技術

病毒性心肌炎主要由B3型柯薩奇病毒（CVB3）感染所致，青壯年發病較高，可導致約50%的人類急性及慢性心肌炎和25%擴張性心肌病的發生，是一常見、多發的心血管系統疾病。目前尚無有效的預防或治療疫苗。CVB3屬于腸道病毒，通過呼吸道、胃腸道入侵機體后，由于機體粘膜免疫（如腸道IgA）不能在感染早期及時清除病毒，使病毒迅速擴散入血、進而侵犯心臟，導致病毒性心肌炎；CVB3的持續性感染還可能導致擴展性心肌病的發生，致死率極高，危害嚴重。當前導致嚴重感染性疾病的病原體如人類免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒、嚴重急性呼吸綜合征病毒（SARS-CoV）等均通過粘膜表面（生殖道、呼吸道、胃腸道）入侵和感染機體，由于機體不能誘導有效的粘膜免疫應答清除粘膜感染病原體，使病原體迅速擴散入血、進而侵犯全身，造成機體損傷；同時發展為慢性感染，導致慢性疾病的行成。

對于以上經粘膜感染病原體，如能誘導粘膜局部（鼻咽、胃腸道）的特異性粘膜免疫應答，特別是特異性的SIgA的形成和分泌，則可能在感染初期有效中和病毒，避免病毒入血而后感染全身器官，從而有效的阻止病毒性心肌炎的發生。因此研制出有效誘導SIgA分泌的粘膜疫苗迫在眉睫。

已知常規疫苗如滅活、蛋白疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等，經常規途徑免疫（肌肉注射、皮下等）通常不能誘導特異性粘膜免疫應答。無論疫苗的形式是什么，要誘導粘膜免疫應答通常需要將靶抗原從粘膜部位接種，才能被粘膜中APC攝取并提呈，激活粘膜免疫系統，誘導粘膜免疫應答。

已知的粘膜接種抗原的瓶頸在于：粘膜局部纖毛的頻繁物理擺動可迅速清除外來抗原；粘膜局部存在大量酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外來抗原。因此粘膜部位接種抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能誘導有效的粘膜免疫應答。即使誘導，其應答程度非常低下。

水皰型口炎病毒（VSV）能感染多種動物和昆蟲。家畜中自然感染VSV的有馬、牛（羊）、豬，而人群中自然狀態下幾乎不存在水皰型口炎病毒主動感染，對人的感染不會引起很明顯的病癥，因此將水皰型口炎病毒作為病毒載體疫苗是有潛在的可行性的。水皰型口炎病毒病毒內部為緊密盤旋的螺旋對稱的核衣殼，VSV基因組為不分節段的線性單股負鏈RNA，長約11kb。從3’→5’端依次排列著N、NS（P）、M、G、L等5個不重疊的基因，分別編碼核（N）蛋白、磷酸（P）蛋白、基質（M）蛋白、糖（G）蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5種不同的主要蛋白。其中核蛋白（N）和糖蛋白（G）在病毒免疫具有重要的意義。N基因編碼的病毒核蛋白（N蛋白），它可有效的保護病毒RNA免受各種核酸酶的消化。N基因編碼的N蛋白呈群特異性，為許多型和亞型所共有，有高的抗原性，且在轉錄復制中擔任了重要的角色。進入細胞的VSV的N蛋白作為優勢抗原被VSV特異性CTL細胞識別，誘導CTL發揮作用，參與免疫反應。因此VSV作為病毒載體攜帶靶抗原，會增強機體的免疫應答強度，采取的粘膜部位接種免疫方式則會誘導機體產生更強的特異性黏膜免疫應答。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種用于預防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應用，所述的這一種用于預防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應用解決了現有技術中的疫苗對B3型柯薩奇病毒（CVB3）感染所致病毒性心肌炎效果不好的技術問題。

本發明為一種重組病毒，以水皰型口炎病毒為載體，在所述的水皰型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之間插入編碼抗原CVB3結構蛋白VP1基因。

進一步的，所述的編碼靶抗原CVB3結構蛋白VP1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

進一步的，所述的CVB3結構蛋白來源于CVB3Nancy株。

進一步的，所述的水皰型口炎病毒來源于水皰型口炎病毒印第安納株。

進一步的，上述的重組病毒通過反向遺傳重組質粒在BHK21細胞中包裝出重組的水皰型口炎病毒。

本發明還提供了上述的一種重組病毒的制備方法，通過如下方法制備：

（1）選擇靶抗原CVB3結構蛋白VP1基因，以質粒pXN₂為載體，在所述的pXN ₂載體中插入編碼靶抗原CVB3結構蛋白VP1基因，得到重組質粒pXN₂-VP1。

（2）在培養皿中培養BHK細胞，待細胞長滿40～70%的時候，收集BHK細胞；