[發明專利]一種快速提取真菌基因組DNA的方法

在審

• 申請號: 201410124660.0
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN104946622A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 邊銀丙;王剛正;樊曉琳
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速提取真菌基因組DNA的方法。

技術背景

大型真菌是世界上極為重要的微生物，在人們的生活中扮著重要的角色。木霉對植物病害的防治作用；青霉代謝產物對人們疾病有著很好的防治作用；食用菌具有重要的營養價值和保健功能，能滿足人們對健康食品的需求，食用菌產業能大量轉化利用農作物秸稈，食用菌與人類生活的關系日益密切，如茯苓是中藥的四大輔藥之一，靈芝能提高人們的免疫能力，香菇富含膳食纖維和具有調節人體免疫能力的多糖類物質，冬蟲夏草對人體代謝機能具有平衡調和作用等。因此，對大型真菌進行更深一步的研究，就顯得非常必要。

分子生物學技術迅猛發展，并滲透到各個學科領域，分子生物學技術是探索生命科學奧秘的基石。隨著一些大型真菌基因組序列分析的開展，克隆技術為木霉在植物病害上生防作用及青霉的在人類疾病方面起了重要的作用，分子輔助育種將成為食用菌產量提高、品質改良的重要途徑。在分子生物學研究中，優良的DNA是開展研究的基本前提，快速高效地獲得質量優良的基因組DNA具有非常重要的意義。

大型真菌具有富含幾丁質的細胞壁，且含有各種復雜的多糖成分，導致提取的DNA溶液中雜質較多，提取過程繁瑣。目前大型真菌基因組DNA提取方法主要參考植物基因組DNA提取的方法，如：CTAB法、SDS法、尿素法、氯化芐法、試劑盒法等。CTAB法和SDS法提取的DNA含量相對較高，但DNA純度相對較低；尿素法提取的DNA中酚類、糖類等雜質含量相對較高，對后續的研究有一定的影響；氯化芐法，提取步驟雖簡便易行，但DNA質量不夠穩定，對于在提取緩沖液中分散性不好的材料，DNA的提取效果不好；試劑盒法提取的DNA純度相對較高，但DNA含量相對偏低，且成本較高。上述幾種方法在提取過程中，加入裂解液后，需要在65℃水浴條件中水浴30-60min，水浴過程中還需要每隔幾分鐘搖動一次，加入PCA后，需要搖動10min左右，然后靜置10min，整個流程相當耗時費工。Tris飽和酚法提取的基因組DNA電泳條帶顯示出彌散。

隨著分子生物學學科發展，非常必要找到一種快速高效獲取DNA的方法。本方法旨在保證DNA質量的前提下，縮短提取時間。

發明內容

本發明提供了一種快速提取真菌基因組DNA的方法，該方法提取真菌基因組DNA所用時間短，提取成本低，效率高，操作方便，且獲取的基因組DNA質量穩定，能夠直接用于測序等進一步的研究工作。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種快速提取真菌基因組DNA的方法，步驟如下：

（1）取材：放置-70℃保持的菌絲或者子實體，放到預冷的研缽中；

（2）加入液氮研磨至粉末狀，將粉末加入滅菌的離心管中；

（3）加入裂解液，混勻，所述的裂解液的配方為：100mM?Tris-HCl(pH=7.8),20mM?EDT?A,1.4M?NaAc,2%(w/v)CTAB,0.5%（v/v）SDS；

（4）加入PCA，混勻，PCA配方為：氯仿：苯酚：異戊醇=25:24:1，體積比；

（5）離心；

（6）取上層水相至另一離心管中，加入3M醋酸鈉，再加入預冷的無水乙醇，-20℃放置5-10min；

（7）離心；

（8）棄上清，用75%的酒精漂洗沉淀，離心，棄上清；

（9）加入ddH₂O和RNase,溶解，-20℃保存。

上述方案中，所選取的菌絲或子實體選自：香菇(Lentinula?edodes)，赤芝（Ganoderma?luci?dum）、茯苓（Poriacocos）、茶樹菇（Agrocybe?cylindracea）、金針菇（Flammulina?velutipes）、杏鮑菇（Pleurotus?eryngii）、毛木耳（Auricularia?polytricha）、蛹蟲草(Cordycepts?militars）或綠色木霉（Trichodermaviride）。

優選的步驟（3）中，加入裂解液后，優選的混勻時間為10-15s；

上述方案中，步驟（4）中，加入PCA后，混勻時間為30s；

上述方案中，步驟（5）中，離心的最佳轉速為12000rpm，離心時間為2min。

上述方案中，步驟（5）離心后，若中間層有白色沉底，重復步驟（4）和（5）直至無白色沉底。