[發明專利]一種克隆牦牛eVEGF120基因編碼區全序列的方法

在審

• 申請號: 201410124048.3
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN103898097A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 梁春年;吳曉云;閻萍;丁學智;包鵬甲;郭憲;王宏博;裴杰;褚敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種克隆牦牛eVEGF120基因編碼區全序列的方法，其特征在于包括下述步驟：

1)從牦牛肝組織中提取總RNA，將總RNA反轉錄成cDNA；

2)以步驟1)的cDNA作為模板，采用下述引物進行PCR：

上游引物P1：5‘-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTACA-3’；

下游引物P2：5‘-TGGGTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCC-3’；

3)回收和純化上述PCR產物，獲得目的基因片段；

4)將目的基因片段與pMD-19T載體連接加入到DH5α感受態細胞中進行轉化培養，篩選其中的陽性菌落進行培養，以菌液為模板進行PCR即得eVEGF120基因片段全序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)采用牦牛的肝臟組織提取總RNA。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于將牦牛的肝臟組織于液氮環境下研磨成粉末，然后依次加入Trizol液、氯仿，室溫靜置后高速離心；取離心的上清液與異丙醇混勻后高速離心；取離心沉淀物用乙醇漂洗雜質后進行離心，離心的沉淀物變色后加入DEPC水用瓊脂糖凝膠電泳檢測，將合格的RNA反轉錄成cDNA。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)采用梯度PCR，溫度的梯度范圍在55℃到65℃之間。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)采用純化回收試劑盒回收PCR產物。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于還包括將步驟4)所得eVEGF120基因片段全序列與普通牛eVEGF120基因片段全序列進行同源性比對驗證的步驟。