[發明專利]一種克隆牦牛eVEGF120基因編碼區全序列的方法

在審

• 申請號: 201410124048.3
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN103898097A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 梁春年;吳曉云;閻萍;丁學智;包鵬甲;郭憲;王宏博;裴杰;褚敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及克隆牦牛eVEGF120(vascular?endothelial?growth?factor120)基因編碼區全序列的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

VEGF(血管內皮生長因子)由Ferrara等首次在牛垂體濾泡細胞中發現。其主要通過與血管內皮細胞表面特異性受體結合發揮生物學功能。VEGF與其受體結合后，能引起受體的自身磷酸化，經過一系列的調節，引起內皮細胞分裂、增生。

已有的研究發現，VEGF及其家族成員廣泛存在于人和動物體內的多種器官，VEGF在機體適應低氧環境的過程中發揮重要作用，低氧環境能刺激VEGF及其受體在人和動物的內皮細胞和組織細胞中表達并發揮生物學功能。VEGF基因在低氧條件下能增加人腦部血管的通透性，并且參與高原腦水腫的病理過程。

人的VEGF基因由8個外顯子和7個內含子組成，外顯子的選擇性剪接形成4個不同的異構體(VEGF120，VEGF165，VEGF189，VEGF206)。與其他亞型相比，VEGF120缺乏第6和第7外顯子的編碼產物。VEGF第6外顯子編碼的蛋白對肝素具有較高的親和力，因此VEGF120在胞外呈游離狀態。低氧條件下，VEGF亞型表達水平可能與骨骼肌生理結構的差異有關；不同動物骨骼肌中VEGF亞型表達模式可能存在差異，不同VEGF亞型對低氧的敏感性不同。目前對于VEGF的研究都集中在VEGF165上，而對于VEGF120的研究很少。

同時，對于如何有效地得到eVEGF120基因編碼區全序列本領域研究甚少，傳統的方法，例如分段PCR克隆法或cDNA末端快速擴增法在eVEGF120上也存在諸多缺陷。前者需要把基因分成若干段分別克隆，分成幾段就需做幾次亞克隆，然后再進行序列拼接，造成工作量大，成本高，且有序列堿基錯讀的可能；后者必須已知一段基因的cDNA片段，然后往兩端延伸擴增從而獲得完整的cDNA全序列，這種方法具有盲目性，擴增的PCR產物長度不明確，而且對實驗技術要求高，工作量大，造成實驗成本高。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明公開了一種克隆方法，能夠簡單、快捷的獲取牦牛eVEGF120基因的完整編碼區序列，本發明公開的方法具有目的片段長度明確，實驗工作量小，實驗成本小的特點。

在本發明中，所針對的牦牛eVEGF120基因序列，具體的序列可參考序列SEQUENCE?LISTING所示。

本發明所公開的克隆方法，具體是通過下述技術方案實現的：

一種克隆牦牛eVEGF120基因編碼區全序列的方法，包括下述步驟：

1)從牦牛肝組織中提取總RNA，將總RNA反轉錄成cDNA；

2)以步驟1)的cDNA作為模板，采用下述引物進行PCR：

上游引物P1：5‘-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTACA-3’；

下游引物P2：5‘-TGGGTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCC-3’；

3)回收和純化上述PCR產物，獲得目的基因片段；

4)將上述PCR獲得的目的基因片段與pMD-19T載體連接加入到DH5α感受態細胞中進行轉化培養，篩選其中的陽性菌落進行培養，以菌液為模板進行PCR即得eVEGF120基因片段全序列。

其中，上述所用的PCR引物是根據普通牛eVEGF120基因序列所設計的。

在本發明中，克隆牦牛eVEGF120基因編碼區全序列的組織優選采用牦牛的肝臟組織提取總RNA，具體的提取方法如下所述：

將牦牛的肝臟組織于液氮環境下研磨成粉末，然后依次加入Trizol液、氯仿，室溫靜置后高速離心；取離心的上清液與異丙醇混勻后高速離心；取離心沉淀物用乙醇漂洗雜質后進行離心，離心的沉淀物變色后加入DEPC水用瓊脂糖凝膠電泳檢測，將合格的RNA反轉錄成cDNA。

在上述中，所用的詞匯“高速離心、離心”是根據所用離心機的性能來描述的，一般來說高速離心的設定為不低于10000g，通過提高離心速度有利于降低離心時間；通常的離心設定為不高于10000g，或更低，例如8000g。

在上述中，室溫采用生物學上常用的室溫環境，一般為15℃；離心在4℃下進行。

在本發明中，步驟2)采用梯度PCR，溫度的梯度范圍在55℃到65℃之間。

上述PCR過程采用梯度PCR儀進行，在所給定的溫度范圍內設置多種退火溫度條件(12種溫度梯度或8種溫度梯度，優選為8種)選出表達量高的最適合退火溫度進行有效的擴增。